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Location:ホーム実験手法別製品・技術情報タンパク質サンプル調製・前処理

第1章
タンパク質サンプル調製の概要(3)

各分析手法の夾雑物許容性と分析能

各分析手法の夾雑物許容性

ESI-MS

エレクトロスプレーイオン化(ESI)手法は夾雑物による影響を大きく受けます。サンプルに含まれるバッファー、塩および界面活性剤の量は最少限に抑える必要があります。水、有機溶媒、揮発性の酸または塩基しか含まれない状態が理想的です。リン酸、トリス、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)などのバッファーは使用できません。このようなバッファーは微量であってもESIプロセスに干渉します。バッファーが必要な場合には、酢酸アンモニウムなどの揮発性バッファーを30 mM以下の濃度で使用できます。イオン性界面活性剤は微量の使用も避ける必要がありますが、一定の非イオン性界面活性剤(n-ドデシル-β-D-グルコピラノシドなどの非イオン性糖類)の場合、濃度が0.01%から0.1%までの間であれば有用なデータが得られることがあります (12)。

MALDI-MS

ESIと比べ、マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)手法は塩の影響や一定の少量の界面活性剤の影響を比較的受けにくい手法です (13)。ただし、感度および得られるデータの質はサンプルの純度に大きく依存します。塩、バッファー、界面活性剤の量を最小限に抑えた場合に最善の結果が得られます。表1.3に、各種夾雑物質に対するおよその許容レベルを示します。また、いずれの成分も、マトリックスの濃度(約50 mM)を超える濃度で存在する場合は、問題を引き起こす可能性があります。

表1.3 一般的な夾雑物に対するMALDIの許容性。およその値と考えてください。マトリックスの種類、スポッティング手法、および夾雑物組み合わせ効果により正確な許容性は異なります(参考文献14の表16.2.1)。

Contaminant Maximum concentration
Sodium chloride 50 mM
Phosphate 10 mM
Tris base 50 mM
Urea 1 M
Guanidine 1 M
Azide 0.1% (v/v)
Glycerol 1% (v/v)
Polyethylene glycol (PEG) 2000 0.1% (w/v)
Sodium dodecly sulfate (SDS) 0.01% (w/v)
Triton X-100, RTX-100, NP-40 0.1% (v/v)
Tween 0.1% (v/v)
CHAPS 0.01% (w/v)
n-Octyl-β-glucopyranoside 1% (v/v)
ZwittergentTM 0.1% (v/v)
Lauryldimethylamine oxide (LDAO) 1% (w/v)

 

二次元ゲル電気泳動

二次元電気泳動の一次元目等電点電気泳動(IEF)ステップは、低分子量のイオン性不純物の影響を特に大きく受けます。塩は、濃度が比較的低くても(< 5 mM)、分離速度を低下させるか、明瞭なフォーカシングを妨害するか、二次元ゲル電気泳動の結果の質を低下させる障害を引き起こすことがあります。サンプルに含まれるその他の非タンパク質不純物も分離を妨害し、その後、二次元展開の分析の結果の可視化を妨げることがあります。表1.4では、二次元展開の分析の結果に対しマイナスの影響を及ぼす夾雑物の種類と説明を示します (15)。

表1.4 二次元ゲル電気泳動にマイナスの影響を及ぼす夾雑物の説明

Contaminant Comments
塩、バッファー残渣、サンプル調製により持ち込まれるそのほかの荷電低分子 塩は電気泳動プロセスを妨害するため、除去するか、できる限り低濃度に維持しなければなりません。固定pH勾配(IPG)ストリップに塩が含まれると、ストリップの電気伝導度が高くなります。イオンがストリップ端に達するまでタンパク質がフォーカスされないため、IEFに要する時間が長くなります。水の移動が起こることもあり、その場合、ストリップの一端が乾燥し他端が膨潤します。IPGストリップに塩が含まれると、IPGストリップのいずれか一端に、タンパク質がフォーカスされない広い領域が生じます(最終結果に横すじが現れるか、空白の領域が生じます)。サンプルでIPGストリップを膨潤させる場合、膨潤液の塩濃度は10 mM未満とする必要があります。サンプルカップを用いてサンプルをアプライする場合、最大50 mMの塩濃度に耐えられます。しかし、サンプルアプライ時点でタンパク質が塩濃度の低い環境に急激に移動することから、タンパク質が沈殿することがあります。
内因性の小型イオン分子 (ヌクレオチド、代謝物、 リン脂質など.) 内因性の小型イオン性分子はどの細胞溶解液にも含まれています。このような物質は負電荷を帯びていることが多く、陽極方向のフォーカシングが妨げられることがあります。
イオン性界面活性剤 タンパク質抽出にはしばしばイオン性界面活性剤(一般にSDS)が使用されますが、この物質はIEFに強く干渉することがあります。SDSはタンパク質と複合体を形成し、その結果生じる負電荷を帯びた複合体はSDSを除去または隔離しない限りフォーカスされません。
核酸 (DNA, RNA) 核酸はサンプルの粘性を高め、バックグラウンドスメアを発生させます。高分子量の核酸は静電相互作用を通してタンパク質と結合し、フォーカシングを妨害することがあります。サンプルから分離されたタンパク質を銀染色で可視化すると、ゲル中に存在する核酸も染色され、二次元ゲル上にバックグラウンドスメアが生じます。
多糖類 多糖はゲルの孔を詰まらせて沈殿を引き起こすかフォーカシング時間を延長し、その結果、横すじを発生させることがあります。一部の多糖は負電荷を帯びており、静電相互作用によりタンパク質と複合体を形成することがあります。
脂質 多くのタンパク質、特に膜タンパク質は脂質と複合体を形成しています。複合体形成はタンパク質の溶解性を低下させ、またpIと分子量の両方に影響を及ぼします。脂質は界面活性剤と複合体を形成し、可溶化の効率を低下させます。脂質に富んだ組織の抽出液を遠心分離するとしばしば脂質層が生じ、除去が困難な場合があります。
フェノール化合物 フェノール化合物は多くの植物組織に存在しており、酵素が触媒する酸化反応を介してタンパク質を修飾することがあります。
不溶性物質 サンプル中の不溶性物質はゲルの孔を詰まらせ、フォーカシングを妨げます。サンプルカップを使用してサンプルをアプライする場合、不溶性物質がIPGストリップへのタンパク質の移行を妨げる可能性があるため、特に問題となります。

 

一次元SDS-PAGE

一般に、明瞭で歪みがなく幅が一定したバンドを得るには、各サンプルに同じバッファーを使用し同じイオン組成を持たせなければなりません。

 

トリプシン消化

トリプシンは、最適操作pH 8、最適操作温度37°Cのセリンプロテアーゼです。トリプシンは主としてリジンおよびアルギニンのカルボキシル末端(C末端)側でタンパク質を切断します。ただし、これらのアミノ酸の次にプロリンが存在する場合を除きます。アミノ酸配列分析グレードのトリプシンは、大規模な自己触媒反応を防ぐために、一般にリジン残基がメチル化されています。ほとんどの場合、揮発性バッファーが理想的です(50 mM NH4HCO3[pH 7.8])。一般に、1 Mの尿素または最大10%のアセトニトリルの存在下で切断時間が短縮し完全性が高まる一方、還元剤はトリプシンを不活化します。

 

クロマトグラフィー

どのようなクロマトグラフィー担体でも夾雑物で孔が詰まる可能性があります。夾雑物が異なれば、影響を受けるクロマトグラフィー担体の種類も様式も異なり、これはクロマトグラフィーの分離機構によって決まります。例えば、塩はIEXに干渉し、界面活性剤と脂質はHICによる効率的な分離を妨げることがあります。カラムを使用する場合には、孔の詰まりを防ぐために目に見える微粒子をサンプルから除去する必要があります。特に、サイズに基づいて分子を分離するGFでは、この操作が重要です。微粒子を除去するには、サンプルを0.45 μmまたは0.5 μmのフィルターに通します(第4章で説明します。必ずタンパク質吸着性が低いフィルターを使用してください)。

 

タンパク質分析手法の分析能

タンパク質の網羅的分析は複雑かつ困難な作業です。この理由は主として、化学的特性の不均一性が高く、核酸増幅に用いられているポリメラーゼ連鎖反応(PCR)と同等の一般的な増幅手法が存在しないことによります。しかし、タンパク質分析に使用できる手法として、網羅的手法と標的手法がともに多数存在するのも事実です。前述したように、このハンドブックでは電気泳動とMSに基づいた手法に焦点を当てています。この2通りの手法は、特定タンパク質非依存的分析にも(二次元ゲル電気泳動および網羅的MS)、タンパク質標的分析にも(ウエスタンブロッティングおよび標的MS)使用できます。タンパク質の発現分析に関係する分析能のおよその比較(大規模サンプル調製を利用しない場合)を表1.5に示します。参考までに、最先端のアフィニティーベースの分析法(例:ビーズベースのタンパク質アッセイ、プロキシミティライゲーションアッセイなど)に関するデータを補足しています。

表1.5 カテゴリーに分類したタンパク質分析手法の分析能の指標。正確な値は使用する機器、プロトコールおよびサンプルによって大きく異なります。

手法 ダイナミックレンジ 感度 分解能/ 多重化 参考文献
二次元電気泳動 102 -103 10–100 ng/ml ~2–5000 proteins (2, 3, 16, 17)
Global quantitative MS including RPC peptide separation 102 -103 1–10 ng/ml ~ 1000 proteins (2, 3, 18, 19)
Targeted quantitative MS including RPC peptide separation 104 -105 0.1–1 ng/ml ~ 20–100 known proteins (20–22)
ウェスタンブロッティング 103 -104* 10–100 pg/ml A few known proteins (23, 24)
Affinity-based assays 105 -106* < 0.1 pg/ml ~10–100 known proteins (25, 26)

* 1種類のタンパク質を分析した場合のダイナミックレンジを示します。抗体の濃度調整等によってダイナミックレンジや、感度の下限が変わることがあります。

タンパク質サンプル調製ハンドブック目次1章 References 略号と用語、記号解説


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