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Hot Start Mix RTG反応原理 -プライマー隔離法-

プライマー隔離法の原理

illustra Hot Start Mix RTGにはホットスタート活性化因子というタンパク質が含まれます。この因子が、実験準備中にプライマーに結合することで、鋳型DNAや他のプライマーとの結合を防ぎます。ホットスタート活性化因子は通常のPCRサイクルの最初に加えられる熱変性ステップで不活性化されるため、PCR後のアプリケーションを阻害しません。

初期内容物

凡例
黒い線 鋳型
青と緑の線 プライマー
黄色の三角 DNAポリメラーゼ
青い丸 dNTPs
赤い星 ホットスタート活性化因子

初期内容物はPCR酵素、dNTPs、ホットスタート活性化因子

反応準備中

ホットスタート活性化因子がPCRプライマーに結合し、実験準備中の非特異的プライマーダイマーの形成および増幅を抑制します。
水とプライマー、テンプレートを加えた図

増幅反応開始

95℃に加熱することでホットスタート活性化因子がPCRプライマーから外れます。その後PCRプライマーは鋳型DNAに特異的に結合して増幅反応が始まります。
特異的な増幅の図

増幅反応後

プライマー隔離法により、特異性の高いPCR産物が高効率で得られます。
特異的な増幅産物の図

使用例

ヒトゲノムDNAを鋳型とし、Hot Start Mix RTGとA社Taq DNAポリメラーゼを使用して反応液を調製しました。PCR前にプライ マーダイマーが形成しやすい条件(25℃、1時間)においた後、反応を行った結果を示します。

電気泳動写真

Hot Start Mix RTG(レーン1、2)では、目的の1,018 bpフラグメントが収量(295 ng)、特異性とも高く増幅されているのがわかります。A社Taq DNAポリメラーゼ(4、5)では、目的フラグメントの収量が低く(40 ng)、低分子量の非特異な増幅もみられます。

※レーン3、6:反応液から鋳型DNAを除いたネガティブコントロール。

  • プライマーダイマーの形成を抑制し、高い増幅性を実現
  • プライマー隔離法によりPCR開始前のポリメラーゼ活性を90%以上阻害

動画で見るプライマー隔離法

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