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Location:ホーム実験手法別製品・技術情報GST融合タンパク質発現・精製、その他

組換えタンパク質の精製―応用例

AKTAdesignシステムと高流速対応のRESOURCEカラムを組合せて、短時間で最適な精製条件が得られます。ここではRESOURCE Q 1 mlを用い、流速4.8 ml/min(900 cm/h)にてpH 5~9の範囲でpHスカウティングを行い(データ一部掲載)、精製条件を至適化した後、SOURCE 15 Q PE 4.6/10を用いて同一サンプルを精製しました。

応用例1:大腸菌粗抽出液からのワンステップ精製

SDS-PAGE:

PhastGel Gradient 10-15

染 色:

Silver Staining Kit, Protein

レーンM:

LMW Marker Kit

レーンO:

大腸菌粗抽出液

レーン 7~12:

溶出フラクション

システム:

AKTAexplorer 10S

カラム:

SOURCE 15 Q PE 4.6/10

サンプル:

h-PCNA産生大腸菌抽出液(0.5 ml)

バッファー:

BufferPrep AIEX Mixture(pH 5.0~9.5)

溶出:

100% B=1 M NaCl

グラジエント:

20→50% B;12 CV

流速:

300 cm/h(0.8 ml/min)

フラクション:

1 ml(30% Bでスタート)

応用例2:封入体からの精製例

HiTrap Chelatingを用いた(His)10-tagged proteinの精製

カラム:

HiTrap Chelating HP 1 ml

金属イオン:

Ni2+

サンプル:

(His)10-tagged proteinを含む可溶化封入体

可溶化バッファー:

6 M 塩酸グアニジン、100 mM イミダゾール

結合バッファー:

6 M 塩酸グアニジン、100 mM イミダゾール

溶出バッファー:

6 M 塩酸グアニジン、500 mM イミダゾール

SDS-PAGE:

PhastGel Gradient 10-15

染 色:

Silver Staining Kit, Protein

レーン1、7:

LMW Marker Kit

レーン2:

細胞抽出画分

レーン3:

素通り画分

レーン4:

洗浄画分

レーン5:

溶出画分(最初の2 ml)

レーン6:

溶出画分(最後の2 ml)

6 M塩酸グアニジン存在下での精製例

注)(His)10-tagged protein は Dr. C. Fullert と S. Brasher, Department of Biochemistry, University of Cambridge, UK のご厚意により提供されたものです。

応用例3:大腸菌で発現させたGST融合タンパク質の精製例

ゲ ル:

ExcelGel SDS Gradient 8-18

システム:

Multiphor II

レーン1、8:

LMW Marker Kit

レーン2:

クルードサンプル

レーン3:

GST融合タンパク質溶出画分
(GSTrap FF 1 ml使用)

レーン4:

GST融合タンパク質溶出画分
(GSTrap FF 5 ml使用)

レーン5:

GSTフリーの目的タンパク質溶出画分
(16 h Thrombin 処理後、
GSTrap FF 1 mlより溶出)

レーン6:

GST溶出画分

レーン7:

Thrombin溶液(20 U/ml+結合バッファー)

カラム:

GSTrap FF 1 ml

サンプル:

GST融合タンパク質を含む大腸菌抽出物8 ml

結合バッファー:

PBS(10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4,
140 mM NaCl,2.7 mM KCl, pH 7.3)

溶出バッファー:

10 mM 還元型グルタチオン, 50 mM Tris-HCl,
pH 8.0

流 速:

1 ml/min

システム:

AKTAexplorer 10S



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