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Location:ホーム実験手法別製品・技術情報ウェスタンブロッティング

ウェスタンブロッティングの原理

ウェスタンブロッティングは、電気泳動の優れた分離能と抗原抗体反応の高い特異性を組合わせて、タンパク質混合物から特定のタンパク質を検出する手法です。SDS-PAGEや等電点電気泳動、二次元電気泳動後のゲルからタンパク質を電気的にメンブランに移動・固定化してブロット(メンブラン)を作製します。メンブランには、タンパク質が結合しやすい疎水性の高いニトロセルロースやさらに疎水性に優れたPVDF(Polyvinylidene difluoride)が用いられます。続いて、ブロットを目的タンパク質に対する抗体と反応させて検出します。検出法には酵素を用いる系、蛍光を用いる系などがあります。酵素を用いる系では、AP(Alkaline phosphatase)やHRP(Horse radish peroxidase)などで標識した二次抗体を一次抗体に反応させて、酵素活性による発色や化学発光により検出します。化学発光による検出には、X線フィルムへの露光検出、あるいは化学発光を検出可能なスキャナーを必要としますが、発色法に比べて10~50倍以上も感度が高いので、微量タンパク質の検出が容易になります。蛍光法は、Cy3やCy5で標識した二次抗体を蛍光検出するので、定量性に優れています。
ゲル電気泳動の高い分離能に、特異性が高い抗原抗体反応を応用することで、細胞抽出液などの複雑なタンパク質溶液中に微量に含まれるタンパク質でも明瞭に検出することができます。ライフサイエンスの様々な分野で、目的タンパク質の検出や解析に利用されています。

→ 最良なウェスタンブロッティングのためのKey Point

 

実験例

ECL Plus検出システムでは、発色法(DAB検出法)の1/20の一次抗体でも同等の感度が得られます。2 % BSAを含む大腸菌懸濁液を10μgから等倍希釈してSDS-PAGE後、Hybond-P(PVDFメンブラン)に転写しました。抗BSA抗体(ウサギ)と抗ウサギHRP標識二次抗体(NA 934)をそれぞれ反応させ、ECL Plus検出試薬およびDAB発色試薬を用いて検出しました。
A)一次抗体は20,000倍希釈、二次抗体は10,000倍希釈でそれぞれ反応させ、ECL Plus検出試薬を用いて検出しました。X線フィルム(Hyperfilm ECL)への露光時間は10分間としました。 B)一次抗体は1,000倍希釈、二次抗体は1,000倍希釈でそれぞれ反応させ、DABを用いて検出しました。DABの発色時間は15分間としました。

結果
ECL Plusを用いた結果では、DAB発色法に比べて一次抗体を20倍、二次抗体を10倍に希釈することでほぼ同等の感度が得られました。2 % BSAを含む大腸菌懸濁液を等倍希釈してサンプルとしているため高濃度側で多少のバックグラウンドが見られますが、ECL Plusの結果はDABに比べ明らかにS/N比が高いことがわかります。

 


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