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Location:ホーム実験手法別製品・技術情報BIA(生物物理学的相互作用解析) > 相互作用解析の王道

Presented by Dr. Kouhei Tsumoto
東京大学大学院
医科学研究所
津本 浩平 先生

実践編-4:フラグメントライブラリーの測定におけるSPR/ITC戦略の実効性と効率的活用法(2)

目次

  1. 結果
  2. まとめ

本記事は「実践編-4:フラグメントライブラリーの測定におけるSPR/ITC戦略の実効性と効率的活用法(1)」の続きです。概略や手法についてはこちらをご覧ください。

ERK2を標的としたフラグメントスクリーニング実例(SPR)

前回、フラグメント化合物の測定では、非特異的結合(NSB)を理解することが重要であることをご説明いたしました。このことから、異なる固定化方法を用いた2つのSPRスクリーニングを行い、それぞれの選出基準を重複して満たしたものが、NSBの影響による偽陽性を排除した"より確からしい"ヒット化合物になると予想しました。標的タンパク質としてMAPキナーゼの一種、ERK2を用い、フラグメントライブラリーとして東京大学創薬オープンイノベーションセンターから得た2000化合物を用いました(図1、2)。

タンパク質と阻害剤の図
図1. 標的タンパク質と既知の阻害剤

ライブラリの概略
図2. Fragment library

図3には実際のセンサーチップCM7を用いたスクリーニングでのセンサーグラムを示して測定条件をご説明しました。実はここでもNSBに対応したいくつかのテクニックを使っているのですが一つだけご紹介します。添加時間が15 secと短いところが特徴的に感じられるかもしれませんが、これはフラグメントの結合を観察するのに必要十分な長さであると同時に、余分なNSB成分をなるべくデータに含ませないようにするためのテクニックです。

センサーグラム
図3. センサーチップCM7を用いたAssay designのセンサーグラム例

続いて、図4にはそれぞれの固定化法を用いたスクリーニングの選出基準をお示ししました。どちらも分子量200でKD=2mMの化合物を狙って設定していますが、固定化方法により特異的な結合レスポンスの大きさやNSBの起こりやすさが異なってくることは前回の表1でご紹介したとおりです。

SPRスクリーニング選出条件
図4. SPRスクリーニング 選出条件(#1-384)

図5に最初の384化合物から選出された8化合物の構造、図6にSPRを用いたそれらのアフィニティー解析の結果をお示ししました。

化合物の構造
図5. SA/CM7 overlap hits from #1-384

SPRアフィニティー解析
SPRアフィニティー解析(continued)
図6. SPRアフィニティー解析(センサーチップSA)

ご覧のとおり#151や#181は溶解度も高く、KDが1 mMを超える弱い相互作用でさえも解析することが可能でした。ところが、#339は溶解度は高いものの、高濃度帯でNSBが観察され正確なKDを得ることはできませんでした。また、#38については溶解度も低く、解離の遅いNSBが観察されやはりKDを算出することはできませんでした。

ヒット化合物の溶解度とアフィニティ
表1. ヒット化合物の溶解度とアフィニティ

このアフィニティー解析では、溶解度やNSBの問題で、すべての化合物に対してKD値を算出したりヒットバリデーションをしたりすることはしばしば困難になりますが、#38のような化合物でも特異的な結合をしている可能性は十分にあります。ここで結合の特異性を確認するために、ポジティブコントロールを用いたSPRの競合アッセイがしばしば行われますが、今回はITCを用い、特異的結合を確認するだけでなく、同時に発熱量ランキングを行うことを試みました。

次へ(ERK2を標的としたフラグメントスクリーニング実例(SPR))


相互作用解析の王道」について

相互作用解析の王道」は、2009年8月よりバイオダイレクトメールでお届けしています。

連載記事一覧
タイトル 配信
ご挨拶 連載「相互作用解析の王道」を始めるにあたって 2009年8月
第1回 原理:其は王道を歩む基礎体力 2009年10月
第2回 実践編その1:抗シガトキシン抗体の相互作用解析例 2009年12月
第3回 対談:アフィニティーを測定する際の濃度測定はどうする? 2010年2月
第4回 実践編-2:相互作用解析手法を用いた低分子スクリーニング その1 2010年4月
第5回 実践編-3:核酸-タンパク質相互作用の熱力学的解析 2010年8月
第6回 概論:タンパク質/バイオ医薬品の品質評価における、SPR/カロリメトリーの有用性 2010年11月
第7回 抗体医薬開発の技術革新~物理化学、計算科学との融合~ 2011年5月
第8回 対談:バイオ医薬品の品質管理技術の発展性~相互作用の観点から~ 2011年8月
第9回 対談:バイオ医薬品の品質管理技術の発展性~タンパク質の構造安定性の観点から~ 2011年9月
第10回 実践編-4:フラグメントライブラリーの測定におけるSPR/ITC戦略の実効性と効率的活用法(1) 2011年10月
第11回 実践編-4:フラグメントライブラリーの測定におけるSPR/ITC戦略の実効性と効率的活用法(2) 2011年12月
参考 用語集  
〈応用編〉連載記事一覧
タイトル 配信
第1回 抗体医薬リードのカイネティクス評価手法の実例 2012年5月
第2回 細胞表面受容体の弱く速い認識を解析する 2012年7月
第3回 SPRを用いた分子間相互作用測定における、“低”固定化量の重要性 2012年8月
第4回 DSC(示差走査熱量計)によるタンパク質の熱安定性評価(1) 2012年9月
第5回 DSC(示差走査熱量計)によるタンパク質の熱安定性評価(2) 2012年10月
第6回 「ファージライブラリによるペプチドリガンドのデザインにおける相互作用解析」 2012年11月
第7回 SPRとITCの競合法を用いたフラグメント化合物のスクリーニングとキャラクタリゼーション 2012年12月
第8回 DSC(示差走査熱量計)によるタンパク質の熱安定性評価(3) 2013年2月
第9回 熱分析とタンパク質立体構造に基づくリガンド認識機構の解析 2013年3月
〈最終回〉
最終回 連載「相互作用解析の王道」を終えるにあたって ~3年間を振り返って、そしてこれから~ 2013年4月

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関連リンク

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東京大学 医科学研究所 疾患プロテオミクスラボラトリー


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