検索のヘルプ

Location:ホーム実験手法別製品・技術情報BIA(生物物理学的相互作用解析) > 相互作用解析の王道

Presented by Dr. Kouhei Tsumoto
東京大学大学院
医科学研究所
津本 浩平 先生

実践編-4:フラグメントライブラリーの測定におけるSPR/ITC戦略の実効性と効率的活用法(1)

目次

  1. はじめに
  2. フラグメントスクリーニングにおけるSPR測定の注意点
  3. 選出されたフラグメントのITCを用いた効率の良いヒットバリデーション法とエンタルピーランキング法(competitive SITE法)(当ページです)

選出されたフラグメントのITCを用いた効率の良いヒットバリデーション法とエンタルピーランキング法(competitive SITE法)

FBDDの分析手法としては、X線構造解析、NMR、そして先にあげたSPRがすでによく使われている手法と言って良いと思います。ITCは、得られるデータが魅力的である反面、必要サンプル量が多いことやスループットが比較的低いことも知られており、FBDD分析手法に組み込むことへはまだ二の足を踏んでいる研究者の方も多いかと思います。

ここでは、何故FBDDにおいてITCのデータが魅力的なのかということと、どうにかしてサンプル量やスループットの問題を軽減できないかということをお話ししたいと思います。 医薬品化合物を設計していくには、高アフィニティーの化合物(KDが小さい、ΔGが負に大きい)を目指して最適化していくことが一般的にされていることですが、そのためのルートとしては(式1)が示すようにエンタルピー変化を負(発熱)に大きくするか、エントロピー変化を正に大きくするかの2通りあるということが言えます。

ΔG = ΔH - TΔS(式1)

※ ΔG:自由エネルギー変化、ΔH:エンタルピー変化、ΔS:エントロピー変化

非常に大まかにいうと、ΔHが負に大きい相互作用は水素結合やファンデルワールス力が大きく寄与しており、結合選択性を期待できる性質をもちます。一方ΔSが正に大きい相互作用は疎水結合が大きく寄与している可能性があります。また、一般的に標的タンパク質との間に水素結合がきちんと起こるように合成デザインすることは難しく、合成展開が進み分子量が大きくなるにしたがって疎水性が増大します。そこでフラグメントスクリーニングにおいては、まずエンタルピー変化が負に大きい(発熱の大きい)フラグメントをまず選出して、その後の合成展開ではエントロピー変化を正に増やす(疎水結合)ことでアフィニティーを高める戦略を取った方が成功しやすいとされています。すなわち、FBDDにおいてITCによってもたらされるサーモダイナミクス情報は非常に大きな武器になり得るのです。

表2のとおり、フラグメントのような弱い相互作用をダイレクトに測定した場合 (Low C ITC法)、相当量のサンプル量と時間が必要になります。またITCのデザイン上、シリンジ側の化合物は10 mMという高濃度が必要になりました。これはいくら水溶性が高いフラグメント化合物でも溶解しないものが相当数出てくる濃度といえます。そこで、アフィニティーの比較的強いポジティブ・コントロールの化合物をシリンジに、タンパク質と過剰量のフラグメント化合物の混合溶液をセル側に入れ、競合アッセイで測定したところ、タンパク質やフラグメントの濃度を下げることができました。さらに、この競合アッセイを10-20回滴定で行っていたところを1回滴定にすることにより、より低濃度で測定時間を減少させることができました。この方法では、ΔG(KD)やΔH、ΔSのような値を定数化することはできませんが、フラグメントの結合に伴う発熱量を間接的に観察することができます。このことを利用して、SPRのスクリーニングで起こるNSBに起因した偽陽性を振るい落とすことも簡単にできます。なぜなら一般的にNSBは熱収支をほとんど伴わないからです。さらに、各フラグメントの相互作用に伴う発熱量をランキングし、よりエンタルピーが寄与している相互作用を有するフラグメントを迅速に選出することが可能になりました。この方法をCompetitive SITEと名付け、実際に適用した実験例を次回ご紹介したいと思います。


表2. 各種ITC測定条件
(→別ウィンドウで大きく表示

最初に戻る


相互作用解析の王道」について

相互作用解析の王道」は、2009年8月よりバイオダイレクトメールでお届けしています。

連載記事一覧
タイトル 配信
ご挨拶 連載「相互作用解析の王道」を始めるにあたって 2009年8月
第1回 原理:其は王道を歩む基礎体力 2009年10月
第2回 実践編その1:抗シガトキシン抗体の相互作用解析例 2009年12月
第3回 対談:アフィニティーを測定する際の濃度測定はどうする? 2010年2月
第4回 実践編-2:相互作用解析手法を用いた低分子スクリーニング その1 2010年4月
第5回 実践編-3:核酸-タンパク質相互作用の熱力学的解析 2010年8月
第6回 概論:タンパク質/バイオ医薬品の品質評価における、SPR/カロリメトリーの有用性 2010年11月
第7回 抗体医薬開発の技術革新~物理化学、計算科学との融合~ 2011年5月
第8回 対談:バイオ医薬品の品質管理技術の発展性~相互作用の観点から~ 2011年8月
第9回 対談:バイオ医薬品の品質管理技術の発展性~タンパク質の構造安定性の観点から~ 2011年9月
第10回 実践編-4:フラグメントライブラリーの測定におけるSPR/ITC戦略の実効性と効率的活用法(1) 2011年10月
第11回 実践編-4:フラグメントライブラリーの測定におけるSPR/ITC戦略の実効性と効率的活用法(2) 2011年12月
参考 用語集  
〈応用編〉連載記事一覧
タイトル 配信
第1回 抗体医薬リードのカイネティクス評価手法の実例 2012年5月
第2回 細胞表面受容体の弱く速い認識を解析する 2012年7月
第3回 SPRを用いた分子間相互作用測定における、“低”固定化量の重要性 2012年8月
第4回 DSC(示差走査熱量計)によるタンパク質の熱安定性評価(1) 2012年9月
第5回 DSC(示差走査熱量計)によるタンパク質の熱安定性評価(2) 2012年10月
第6回 「ファージライブラリによるペプチドリガンドのデザインにおける相互作用解析」 2012年11月
第7回 SPRとITCの競合法を用いたフラグメント化合物のスクリーニングとキャラクタリゼーション 2012年12月
第8回 DSC(示差走査熱量計)によるタンパク質の熱安定性評価(3) 2013年2月
第9回 熱分析とタンパク質立体構造に基づくリガンド認識機構の解析 2013年3月
〈最終回〉
最終回 連載「相互作用解析の王道」を終えるにあたって ~3年間を振り返って、そしてこれから~ 2013年4月

バイオダイレクトメールは弊社WEB会員向けメールマガジンです。バイオダイレクトメールの配信をご希望の方は、下記リンク先からご登録をお願いいたします。

WEB会員およびバイオダイレクトメール読者へのご登録

関連リンク

津本先生の研究内容や論文などはこちら→津本浩平先生の研究室Webサイト
東京大学 医科学研究所 疾患プロテオミクスラボラトリー


お問合せフォーム
※よくあるお問合せとご回答(FAQ)は「こちらで»」ご覧いただけます。
※ファイルを添付してのお問合せは、お手数ですが「Tech-JP@ge.comまでメールにて」お問合せください。
お問合せ内容[必須] お名前[必須]  

注)機種依存文字(①、② など)は使用できません。
大学/企業名[必須]
E-mail[必須]
電話[必須] - - (内線
ご記入いただく個人情報は、当社製品・サービスの提供及び販売促進、当社製品に関する情報の収集・分析及 び提供、新製品・新サービスの研究開発等並びに市場調査のために利用します。当社は個人情報を業務委託 先に預ける場合がありますが、個人情報の取扱いに関する法令、国が定める指針その他の規範に従い、委託先 に対する必要かつ適切な監督を行います。個人情報に関するお問い合わせは個人情報相談窓口(042-5855111:平日午前10時~午後5時)にて承ります。 GEヘルスケア・ジャパン株式会社 個人情報管理責任者
個人情報保護に対する基本方針