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Location:ホーム実験手法別製品・技術情報BIA(生物物理学的相互作用解析)

Biacore 文献情報
バイオ医薬品

  • 基礎研究
    DNAミスマッチ修復タンパク質の複雑な動的修復プロセスを解析
    2015年のノーベル化学賞「DNA修復機構の解明」受賞で知られるMutSの動的な作用機序を検証しています。DNAミスマッチ修復タンパク質MutSは誤ったヌクレオチドを認識し、様々なタンパク質をリクルートする役割を担う重要なDNA結合タンパク質で、二量体と四量体の平衡状態で存在します。本論では定量的な解析を困難にさせる平衡状態での測定を避けるため安定な二量体と四量体のMutSをそれぞれ作製しています。MutSのミスマッチ部位認識からATP結合による“スライドクランプ”フォームへの構造変化に伴うDNA上スライディング機構を、構造情報とともにBiacoreを用いたミスマッチDNAと各MutSの詳細なkinetics解析(ATPの影響も含む)で説明しています。

    参考文献:
    Groothuizen, F. S., et al. (2013)."Using stable MutS dimers and tetramers to quantitatively analyze DNA mismatch recognition and sliding clamp formation."
    Nuclic Acids Res 41(17): 8166-81.
  • 探索・最適化
    Trispecific antibodyの多段階結合試験
    複数の抗原結合部位を同一分子に導入した多価特異性抗体の開発が盛んになっていますが、2017年9月にNIHとSanofi社が、HIV上の3つの部位をを効果的に中和するtrispecific antibody(三重特異性抗体)のin vivoの効果に関する文献を発表されています。このtrispecific antibodyは、HIV上の3つの異なる抗原と結合することができ、サルでのin vivo 試験において単一の中和抗体よりも高い中和効果が得られています。2018年にはPhase I試験を開始予定で、Sanofi社がtrispecific antibodyの製造を開始しています。研究に関わった研究者らは、Trispeficic antibodyはHIV以外の感染症、自己免疫疾患や癌などの疾患に有効なプラットフォームであると述べられています。
    このtrispecific antibodyの評価において、Biacoreは3つの単一抗体をtrispecific antibodyに改変した際にアフィニティーが変化しないかの確認と、3つの抗原を同時に認識できるかを確認する多段階結合試験で使用されています。

    参考文献:
    Xu, L., et al. (2017). “Trispecific broadly neutralizing HIV antibodies mediate potent SHIV protection in macaques.”
    Science358(6359):85-90.
  • 測定技術 生産・管理
    細胞傷害活性評価のためのオルソゴナル技術
    抗体医薬品の機能として細胞傷害活性(ADCC)が機能の1つとして重要なものがあります。従来、細胞傷害性の評価は細胞アッセイが利用されていますが測定間のばらつきが大きい点で、より高頑健性の分子レベルの評価が模索されています。
    Sartorius Stedim BioOutsource社では、バイオシミラーのADCC評価のスクリーニング手法としてBiacoreを使用しています。次のアプリケーションノートでは、Adalimumab、 Etanercept、およびTrastuzumabを標準品として、FcγIIIaとのBiacoreでのsurrogate potencyと細胞アッセイのADCC活性の相関について確認を行い、相関性が高い結果が得られています。このようなオルソゴナルなアプローチはFDAおよびEMAの勧告と整合しており、Biacoreは抗体医薬品の開発段階にとどまらず将来のBiacore製造、品質管理での適用まで拡張しうると述べられています。

    詳細は以下アプリノートから:
    Characterizing biosimilar molecules: Utilizing SPR as an orthogonal technique for demonstrating potency(PDF)
  • 探索・最適化
    抗体医薬品の最適なクリニカルリードの選出のために
    1990年の初代装置の発売直後からBiacoreは抗体医薬品の早期研究開発で抗体抗原の速度論的相互作用解析に用いられてきました。後のHumiraとして知られるD2E7などもその時代の代表的測定例の一つです。近年はバイスペシフィック抗体などの様々な新しいフォーマットの抗体に対して、培養上清中の抗体のスクリーニングから抗体-抗原や抗体-Fc受容体相互作用キャラクタリゼーションやエピトープマッピング、またdevelopabilityの観点でのFcγ受容体やFcRnとの相互作用測定など、クリニカルリードの選出に様々な情報を与えるための適用例が広がっています。
    本アプリケーションノートでは、それらの測定ワークフローの概略を、それをより迅速に進めるための技術的Tipsや抗体測定用のセンサーチップ・キット情報などを織り交ぜながらご紹介します。

    詳細は以下アプリノートから:
    Biacore™ systems in discovery and early-stage development of biotherapeutic antibodies(PDF)
  • 生産・品質管理
    バイオ医薬品の後期開発・QCでの適用法
    バイオ医薬品の後期開発や品質管理品質にはその構造や効果に寄与する特異的結合現象の複雑さから様々な解析法が用いられます。Biacoreはリガンド結合試験に速度論的相互作用情報を加えるだけでなく、その標識抗体不要で高い再現性や頑健性を有するという特徴により、既存のセルベースアッセイやELISA法とともに利用されたり、置き換えられたりしています。
    濃度測定においても吸光度測定では得られない結合活性濃度が得られるのもユニークな点です。本アプリケーションノートでは、Biacoreを用いたバイスペシフィック抗体を例にした力価測定法、Fc受容体との結合解析、安定性試験での利用、Kinetics情報を用いた同等性評価法、検量線不要の濃度測定法などを例にとり、その特長を議論します。

    詳細は以下アプリノートから:
    Biacore concentration and ligand-binding analysis in late-stage development and quality control of biotherapeutics(PDF)
  • 生産・品質管理
    バイスペシフィック抗体のPotency assayのバリデーション
    近年Biacoreを用いた抗体医薬品のPotency assayは盛んにおこなわれていますが、その実際やバリデーションについての論文はそれほど多くありません。本報告では、Roche社のCrossMab (バイスペシフィック抗体)を検体とし、USP1032に記載の3つのモデルの中からParallel-line modelを用いてバリデーションするとともに、ELISAなどに代表される既存の方法と比べた時の利点を議論しています。
    linearity (coefficient of correlation = 0.9997), accuracy (97%) and precision (2%)という優れた結果とともに、早い測定系開発時間や、一回の測定で並行してバイスペシフィック抗体の2つの抗原に対して総和と各々個別のPotencyを同時に評価できる利点を強調しています。

    参考文献:
    Gassner, C., et al. (2015)."Development and validation of a novel SPR-based assay principle for bispecific molecules"
    J Pharm Biomed Anal102,144-9
  • 探索・最適化
    ハイブリドーマ上清からの早期スクリーニングで確かな抗体を選出
    Biacoreを使用した抗体評価はELISA法に代表されるエンドポイントアッセイとは異なりノンラベルでKinetics情報を利用して抗体を選択することができるのが特長ですが、精密なKineticsデータを取得するためには多点濃度の抗原を添加する方法が一般的に推奨され、時間を要します。本文献とアプリノートでは、ハイブリドーマ上清を抗Fc抗体固定化センサーチップ上に添加することで目的の抗体をセンサーチップ上に精製・キャプチャー固定化した後、各抗体に対し1濃度の抗原を添加し早期迅速スクリーニングを行いその妥当性を論じています。(~800hybridomas/day、現行機種(Biacore 8K)ではさらにハイスループット化が可能です)
    参考文献:
    Safsten, P., et al. (2006). "Screening antibody–antigen interactions in parallel using Biacore A100"
    Anal Biochem 353(2), 181–90

    関連アプリノート:
    Early kinetic screening of hybridomas for confident antibody selection using Biacore A100(PDF)
  • 探索・最適化
    抗体評価における熱力学的相互作用情報をどのように使うか
    Best-in-classの抗体の選択において、カイネティクスの温度依存性評価の重要性が認識されてきています。次の文献(Roche社)では、抗原-抗体相互作用について、低温(17 ℃)から高温(37 ℃)にわたる温度依存的な結合速度定数の変化には3つのプロファイルがあり、それらプロファイルと抗原-抗体の結合様式との関連性について紹介しています。リード候補抗体の絞り込み以外にも、ヒト化した抗体評価の指標や、診断用抗体に適しているかの判断指標としても有効だと述べられています。

    参考文献:
    Schraml, M., et al. (2012). "Temperature-Dependent Antibody Kinetics as a Tool in Antibody Lead Selection"
    Methods Mol Biol901,183-94
  • 生産・品質管理
    カイネティクス相互作用情報を同等性試験で簡便に利用するには
    Biacore測定から得られるもっともユニークな情報はKineticsデータであり、医薬品開発の早期から後期まで利用されています。しかし結合・解離速度定数や解離定数の算出は均一な分子同士の相互作用を前提としており、検体や標的分子が不均一性を持ちうる安定性試験やFc受容体との相互作用などで検体の同等性を評価するときに、しばしばそれらの数値の解釈が困難になります。この点を解決するために、同等性試験において、対照-検体のセンサーグラムの結合解離情報を含む形状を “Similarity Score (%)”と呼ばれる数値で評価する手法が開発されました。次の文献では、Similarity Scoreの算出方法や解析時のパラメータ設定、結合解離速度定数とSimilarity Scoreの関連性について種々の相互作用データを使用して紹介しています。さらに、Similarity Scoreの抗体スクリーニングでの有効性についても述べています。
    参考文献:
    Karlsson, R., et al. (2016)."Comparison of surface plasmon resonance binding curves for characterization of protein interactions and analysis of screening data"
    Anal Biochem502, 53–63
    関連アプリケーションノート:
    IgGとFc受容体の定量的な同等性評価法(PDF)
    抗体医薬品の高次構造変化の評価法(PDF)
  • 基礎研究
    抗体に対する結合膜タンパク質の同定
    Biacoreと他手法を使用して、タンパク質または化合物の結合相手を同定している例は幾つか報告されていますが、ここではALMA.7抗体に結合する膜タンパク質をBiacoreとMSを使用して同定しています。まずBiacoreでALMA.7抗体を固定化したセンサーチップに可溶化した血小板の膜タンパク質ライセートを添加して、結合した分子を回収しています。次に、回収溶液中の結合分子を、マグネチックビーズを使用して濃縮後、LC/MS/MSで結合分子の同定を行っています。

    参考文献:
    Ravanat, C., et al. (2009)."Use of tandem Biacore-mass spectrometry to identify platelet membrane targets of novel monoclonal antibodies"
    Anal Biochem 386(2), 237-43
  • 生産・品質管理
    抗体医薬品精製時にCo-purifyされる不純物(HCP)の挙動を解析(Genentech社)
    抗体医薬品は製造に用いた宿主細胞由来のタンパク質(HCP)が混入することがあります。大部分のHCPはProtein Aによる精製で除去されますが、一部は抗体医薬品に結合して原薬とともにco-purifyされ、免疫原性を惹起する可能性があります。実際にGenentech社のLebrikizumabの臨床試験段階でもこのようなHCPの一つのPLBL2が問題となり、精製工程の変更が必要な事態になりました。本論ではこのPLBL2に焦点を当てて詳細な解析を実施しています。具体的には、CHO細胞のpureな培養上清に対していくつかの精製モノクローナル抗体をスパイクし、Protein Aで精製した後の溶出液について、吸光度で総抗体量、ELISAでHCPおよびPLBL2量、LC-MS/MSで未知のHCPやPLBL2ペプチドを検出しています。最後にBiacoreを用いたPLBL2を固定化したセンサーチップにIgG1抗体もしくはIgG4抗体を添加し、その結合量や結合メカニズムの違いについて論じています。

    参考文献:
    Groot, B., et al. (2016). "Investigating interactions between phospholipase B-Like 2 and antibodies during Protein A chromatography."
    J Chromatogr A 1438: 31-8.

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