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お客さまの声・データ紹介 - Ettan DIGE

ご所属:東京大学医科学研究所
  細胞ゲノム動態解析(ビー・エム・エル)
  寄付研究部門

お名前:小迫 英尊 先生、服部 成介 先生
先生&研究室フォト
良いと感じている点
1. 操作がシンプルで、二次元電気泳動の経験がなくても有用なデータが得られる。
2. 定量性が極めて高く、リン酸化によるスポットシフトなどの微妙な変化も高感度に検出できる。
3. 化学蛍光検出法によるウェスタンブロットにより、標識された試料タンパク質と同時に抗原を検出できる。

概要
細胞内シグナル伝達経路のひとつであるERK経路を活性化あるいは阻害した細胞からの抽出液を用いて、ERK経路に関与するタンパク質のリン酸化のによる変動ををEttan DIGEで検出しました。本実験では低発現量のリン酸化タンパク質を検出するために、粗抽出液をリン酸化タンパク質精製カラムで精製してからEttan DIGEでの検出を行いました。
ERK経路概念図
ERK経路概念図(右)

方法
ERK経路を薬剤で制御できるように遺伝子導入したNIH3T3細胞に対して活性化、阻害処理を行い、各々の細胞粗抽出液をPhosphoProtein Purification Kit (QIAGEN)で精製し、Ettan DIGEで検出しました。また、解析したゲルを抗ERK抗体等でウェスタンブロットし、ECL Plus Western Blotting Detection Reagentを用いて検出を行いました。

結果
同一ゲル上の2つの画像イメージ(ERK経路活性化、阻害)の比較から、ERK経路活性化によりリン酸化が増加したと思われるタンパク質が多数検出されました(赤いスポット)。また、このゲルをウェスタンブロットで解析したところ、赤いスポットに一致して複数のリン酸化ERKや下流因子のリン酸化が検出され、ERK経路を構成するリン酸化タンパク質がEttan DIGEで検出できることが確認されました。

DIGE 画像 1
上図 ERK経路活性化により変化したスポット
ERK経路活性化により増加したスポット
ERK経路活性化により減少したスポット
ERK経路活性化により変化しなかったスポット
画像 2 抗ERK抗体で検出されたスポット
(左図の白丸で囲った箇所)

結論
サンプルを適切な方法でプレフラクシネーションすることで目的の低発現量のタンパク質を濃縮し、Ettan DIGEで検出できることが示されました。また、リン酸化タンパク質のようにわずかなスポットシフトが生じた場合でも確実に検出できました。

この実験の内容の詳細に関しては、DIGE アプリケーション資料でも紹介しております。
Ettan DIGEシステムを使用したMAPキナーゼ経路関連リン酸化タンパク質の網羅的解析 (PDF:176KB)


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