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細胞が死なないguide RNAのクオリティを求めて
Dharmacon Edit-R CRISPR Cas9お客様の声

服部 奈緒子 様

服部 奈緒子 様
国立がん研究センター 分子診断・個別化医療開発グループ エピゲノム解析分野

服部先生は、がんの発生や予防、治療に関する研究を、エピジェネティックスの観点から進められていらっしゃいます。短期間の薬剤処理実験にはAccell siRNAによるノックダウンが有効な手段であるものの(詳しくはトランスフェクション試薬を使わないsiRNAだからこそ出来た遺伝子ノックダウン後の薬剤処理実験)、薬剤処理が長期間におよぶ実験にはCRISPR Cas9によるノックアウト法が適切と考えた服部先生は、ゲノム編集実験にも取り組まれてこられました。そこで、これまでの経験から大事と考えるポイントや、探し求めていたInducibleタイプ(Tet-On発現誘導タイプ)レンチウイルスCas9ヌクレアーゼのメリットについて服部先生に伺いました。



大事なポイントその① guide RNAのクオリティ

当時実施していたゲノム編集実験では、オリゴヌクレオチドからin vitro転写でguide RNA(以下gRNA)を作り、精製カラムを通し、トランスフェクションしていました。最初に使用した細胞株では問題は生じなかったのですが、その後の実験で使用した細胞株が、gRNAのトランスフェクションのみで死んでしまいました。精製カラムで取り除ききれない夾雑物が原因と分かり、手法を変える必要に迫られました。


“細胞を死なせない”gRNAのクオリティはDharmacon Edit-R CRISPR Cas9のシステムを導入することでクリアしました。化学合成のため、細胞の生育を阻害するような夾雑物が少ないですし、何よりcrRNAとtrcrRNAを混ぜるだけで実験できるので簡便です。


大事なポイントその② gRNA配列デザインのアルゴリズム

ターゲット遺伝子に対するgRNAをの配列デザインに取り組んだ際、デザインしたどの配列もオフターゲット効果が出てしまう可能性が高く、困っていました。「この遺伝子に対するgRNA設計は無理なのかな」と思いながらも、ゲノム編集に詳しい方に相談したところ、その先生が独自に開発したアルゴリズムでは配列設計ができました。また、Dharmaconのアルゴリズムでも適切な設計ができていました。つまり、失敗要因は遺伝子にあった訳ではなく、配列設計のアルゴリズムにあったのです。今後さまざまな遺伝子に対するゲノム編集実験が増えてくることを考えると、一つ一つ自分たちで配列を設計することは難しく、デザイン済みのgRNAを購入できることが望ましいと考えています。どんなgRNA配列デザインのアルゴリズムを持っているか、はメーカーを選ぶポイントの一つです。「信頼のDharmacon」ということですかね(笑)。


大事なポイントその③ Cas9発現システムの選択

(ポイント①で指摘された)gRNAのクオリティにそれまでの系の限界を感じていたのと同時に、Cas9の発現系についても、より適したシステムにしたいと思っていました。それまでは、Cas9 mRNAを細胞に導入して発現させていたのですが、条件検討を繰り返すと予想以上にコストがかかってしまうので、各種細胞株でCas9定常発現株を作っておいた方がよいかも、と考えていました。更に先日、学会でTet-ONタイプのCas9ベクターを作った人がいたのです。これが欲しい!と思っていた矢先、Dharmaconの大島さんから、「先生出ました!」と紹介されたのがEdit-R Inducible Lentiviral hEF1α―Blast-Cas9 Nuclease Particleでした。現在、この製品を使って細胞株をつくっている最中です。


Inducibleタイプ(Tet-On発現誘導タイプ)のCas9を使うメリットは、“任意の時期までゲノム編集を起こさせない”、ということです。たとえば細胞増殖の調節に関わる遺伝子をゲノム編集でノックアウトする場合、ゲノム編集された細胞が増えなくなり、様々なアッセイのために必要な細胞数まで増幅している過程で淘汰されてしまうリスクがあります。InducibleタイプのCas9であれば、アッセイに必要な細胞数まで増やしてからTet-ONでゲノム編集を起こさせ、その遺伝子の機能を解析することが出来ます。Inducibleタイプ(Tet-On発現誘導タイプ)レンチウイルスCas9ヌクレアーゼを探し求めた理由はここにあります。


 

服部先生、お忙しい中貴重なお時間とご意見をありがとうございました。

※ お客様の使用経験に基づく記載です。



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