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ウェスタンブロッティング こんなときどうする?(6)
~操作時間をできるだけ短くしたい~

ウェスタン テクニカル担当者
回答:ウェスタンブロッティング担当

皆さん、こんにちは。今回はECLシリーズの検出プロトコールを大幅に時間短縮するための実験ガイドを紹介します。

以下のガイドを参考に操作を行うことで、ECLシリーズの検出を約2時間まで短縮できます。

1)メンブレンのブロッキング
  • 高濃度のブロッキング剤を用いることで時間短縮が可能です。弊社のブロッキング剤(ECL Blocking agent:RPN2125)10%を含むPBS-TまたはTBS-Tを用いると、10分間のインキュベートで十分な効果が得られる場合があります(室温、振とう)。スキムミルクをブロッキング剤として用いる場合も同様です。なお、ECL Advanceを使用する場合には、ブロッキング剤の変更やブロッキング時間の短縮はおすすめいたしません。
  • ブロッキング時間の短縮には、高品質なHybond-P(PVDFメンブレン)およびHybond-ECL(ニトロセルロースメンブレン)が適しています。
2)一次抗体の反応
  • ブロッキング後のメンブレンの洗浄時間は短縮することができます。この場合、PBS-TまたはTBS-T中で15秒間ブロットをすすぎ、その後バッファーを交換してさらに15秒間をすすいでください。
  • 一次抗体濃度を上げることにより、感度を下げることなく一次抗体反応時間を20分程度まで短縮できます。インキュベーション時間に合わせて抗体濃度を再検討してください。
  • 一次抗体の洗浄はできる限り多量の洗浄バッファー(PBS-TまたはTBS-T)を用い、3回以上ブロットをリンスした後、室温で10分間洗浄してください。
  • 抗体によっては4℃あるいは37℃でインキュベートすると時間を短縮できる場合があります。
3)二次抗体の反応
  • 二次抗体濃度を上げることにより、感度を下げることなく時間短縮ができます。目安として、4倍濃度で15分間インキュベート(室温、振とう)することで同等の感度を得られます。この場合、バックグラウンドを抑えるために、メンブレンの洗浄は十分に行ってください。
  • 一次抗体の洗浄同様、できる限り大量の洗浄バッファー(PBS-TまたはTBS-T)を用い、3回以上ブロットをリンスした後、室温で10分間洗浄してください。
4)検出
  • 一次抗体および二次抗体濃度を上げると、露光時間を短縮できます。
  • ImageQuant LASのようなCCDイメージャーを使用すると、現像時間が省略されるので、X線フィルムによる検出に比べ大幅に時間を短縮できます。

参考になりましたでしょうか。ぜひお試しください。

また、プロトコールを変更した際には、変更前の結果と比較して、検出感度やバックグラウンドなどに悪影響が出ていないかを確認することをお奨めいたします。

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