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ウェスタンブロッティング こんなときどうする?(1)非特異的なバンドが現れる

ウェスタン担当者
回答:ウェスタンブロッティング担当

さて、今回はウェスタンブロッティングで目的タンパク質以外の非特異的なバンドが検出される場合の対処法です。この場合、まずはサンプルの添加量や抗体濃度を減らしてみてください。抗体濃度の最適化はドットブロットで行います。たとえば、一次抗体の濃度を最適化するときには、二次抗体の濃度を一定にして、一次抗体を数段階(例:1/100、1/500、1/1000、1/5000、1/10000)に希釈して検出してみてください。

また、ECLなどHRP酵素系での検出の場合、サンプルの内在性ペルオキシダーゼに検出試薬が反応してしまい非特異的なバンドが生じることがあります。この可能性を調べるには、抗体処理をせずに検出試薬を反応させてバンドが検出されるかどうかを確認してください。
バンドが検出されてしまう場合には、H2O2処理により内在性のペルオキシダーゼを不活性化させることで改善されます。等量の15% H2O2 in PBS溶液で、ブロッティング後のメンブレンを30分程度インキュベートします。

表1 非特異的バンドが検出される場合の対処法

  原因 解決策
サンプル調製
電気泳動
  • サンプル添加量が多い
サンプル添加量の検討
タンパク量が多いバンドは非特異的な反応が検出されやすくなる

ブロッキング

  •  ブロッキングが不十分
ブロッキング条件の最適化
ブロッキング溶液の濃度を上げる、ブロッキング時間を延ばす、温度を上げるなど、厳しいブロッキング条件下での検討を行ってみる
他のブロッキング剤を使用する
抗体反応
  • 抗体濃度が高い
  • 抗体の特異性に問題がある
抗体を希釈する
抗体の濃度が高いと非特異的な反応が検出されやすくなるため、抗体を希釈して濃度を下げる
特異性の高い抗体を使用する
モノクローナル抗体を使用する
抗体を精製する
別の抗体を用いる
検出試薬との反応
  • 内在性のペルオキシダーゼが検出試薬と反応している
内在性ペルオキシダーゼ由来のバンドを不活性化する
内在性ペルオキシダーゼが検出試薬と直接反応してしまうこともある。抗体を反応させずに検出試薬を反応させてバンドを確認。内在性ペルオキシダーゼが含まれているようであれば、H2O2不活性化の処理で対応する
検出    

 

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