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抗体精製をマスターしよう (9)

モノクローナルIgMの精製

抗体精製イメージ第8回「モノクローナルIgGの高純度精製」では、効率的に高純度のモノクローナルIgGを精製するためのスキームについてご紹介しました。HiTrap IgM PurificationカラムはIgMが2-Mercaptopyridine にThiophilic interactionで結合する性質を利用した精製カラムです。2-Mercaptopyridineには、多数の血清中のタンパク質も結合するため、血清成分が含まれるサンプルからIgMを精製する場合には、他の手法も組み合わせて精製する必要があります。

モノクローナルIgMの精製では、他のクローンとのクロスコンタミネーションを防ぐために、クローンごとに専用のカラムを使用してください。

無血清ハイブリドーマ細胞培養液からの精製

HiTrap IgM Purification カラムによる精製

HiTrap IgM Purificationカラム(1 ml)のプロトコールです。5 ml 以上にスケールアップをする場合には、HiTrap IgY Purificationカラム(5 ml)を使用してください。また、以下のプロトコールの流速およびバッファー使用量を5倍にしてください。

準備するバッファー

  • 結合バッファー: 20 mM リン酸ナトリウム, 0.8 M 硫酸アンモニウム, pH 7.5
  • 溶出バッファー: 20 mM リン酸ナトリウム, pH 7.5

サンプルの調製

1 ml カラムへの添加培養上清量の計算

培養上清中の抗体濃度は 0.01 ~ 0.5 mg/ml 程度です。カラムに添加するサンプル量は、下記方法で求めた最大添加量の1/2 までにします。
→抗体精製をマスターしよう (5) 「結合容量とサンプル添加速度」の項

サンプル量を増やしたい場合は、HiTrapカラムを連結してカラム体積を増やすこともできます。

ハイブリドーマ細胞培養液

遠心(1,500 × g, 10 分)

培養上清

培養液に硫酸アンモニウムを加えて終濃度0.8 Mに調製(室温pH を7.5に調製
遠心(12,000 × g, 10 分)または0.45 µmフィルターろ過

保存中に沈殿が生成することがあるので、使用直前にろ過してください。

HiTrap IgM Purification カラムによる精製操作

カラムの準備

カラムに気泡を入れないように注意しながら、シリンジまたはシステムに接続
5 ml の超純水を流速1滴/秒(または1 ~ 2 ml/min)で送液

カラムの平衡化

3 ~ 5 ml の結合バッファーを流速1滴/秒(または1 ~ 2 ml/min)で送液

サンプルの添加

調製したサンプル溶液を流速1滴/2秒(または0.2 ~ 1 ml/min)で送液

サンプルの添加流速が速すぎるとカラムを素通りすることがあります。

非吸着成分の洗浄

3 ~ 5 ml の結合バッファーを流速1滴/秒(または1 ~ 2 ml/min)で送液

素通り画分は廃棄せずに回収し、精製操作終了後にSDS-PAGEやEIAによって、IgGが素通りしていないことを確認します。

抗体の溶出

5 ml の溶出バッファーを流速1滴/秒(または1 ~ 2 ml/min)で送液

溶出画分の確認

精製IgM

バッファー交換

カラムの洗浄・保存

血清入りハイブリドーマ細胞培養液からの精製

血清入りハイブリドーマ細胞培養液から精製する場合、添加した血清由来のウシIgG が精製IgM に混入します。この場合、上述の操作でIgMをアフィニティー精製した後、混入したIgGをHiTrap Protein G に吸着させて除去します。

精製IgM中に存在するIgGの除去

HiTrap Protein G 1 ml カラムの場合のプロトコールです。5 ml カラムを使用する場合は、流速およびバッファー使用量を5倍にしてください。

準備するバッファー

  • 結合バッファー: 20 mM リン酸ナトリウム, pH 7.0

サンプルの調製

精製IgM 溶液は HiTrap Desaltingカラムで結合バッファーに交換してください。

保存中に沈殿が生成することがあるので、使用直前にろ過してください。

HiTrap Protein Gによる精製操作

カラムの準備

カラムに気泡を入れないように注意しながら、シリンジまたはシステムに接続
5 ml の超純水を流速1滴/秒(または1 ~ 2 ml/min)で送液

カラムの平衡化

3 ~ 5 ml の結合バッファーを流速1滴/秒(または1 ~ 2 ml/min)で送液

サンプルの添加

IgM溶液を流速1滴/2秒(または0.2 ~ 1 ml/min)で送液

IgGはHiTrap Protein Gに結合して除去されます。サンプルの添加流速が速すぎるとIgGがカラムを素通りする場合があります。

非吸着成分の洗浄

3 ~ 5 ml の結合バッファーを流速1滴/秒(または1 ~ 2 ml/min)で送液

素通り画分を1 ml ずつ回収し、SDS-PAGE によりIgGが除去されていることを確認してください。

素通り画分の確認

精製IgM

この方法でもIgMが精製不十分な場合には、ゲルろ過クロマトグラフィーで精製します。

カラムの洗浄・保存

モノクローナル IgMの精製例

HiTrap IgM Purificationカラムは、IgMが2-MercaptopyridineにThiophilic interaction(Porath,1985)で結合することを利用した新しいアフィニティー精製カラムです。IgM以外のタンパク質を含まない無血清培養上清を出発材料とした場合には、ワンステップで高純度なIgMを精製することができます。

2-Mercaptopyridineは、血清中のイムノグロブリンやMacroglobulinなどと親和性をもつため、血清成分が多量に含まれるサンプルや血清からIgM を精製する場合は、イオン交換クロマトグラフィーとゲルろ過クロマトグラフィーを組み合わせた精製が必要です。

HiTrap IgM Purificationカラムによるアフィニティー精製例

5% FCS(ウシ胎児血清)を含むマウスハイブリドーマ細胞培養上清(75 ml)からモノクローナル抗赤痢菌IgMを精製しました。カラムは2-Mercaptopyridineをリガンドに持つHiTrap IgMPurificationカラム 1 ml を使用し、「イオン交換クロマトグラフィーを用いたモノクローナルIgG精製プロトコール」にしたがって精製しました。各ステップの回収画分の活性はELISA で、純度はSDS-PAGE とゲルろ過クロマトグラフィーで分析し、純度80 % 以上のIgMが回収されたことを確認しました。

図4-14

図4-14. マウス モノクローナルIgMの精製

5 ml の結合バッファーでカラムの平衡化を行い、サンプルを添加しました。
続いて15 ml の結合バッファーで洗浄し、10 ml の溶出バッファーで溶出を行いました。
最後に10 ml 洗浄バッファーでカラムを洗浄しました。

  • サンプル: 抗赤痢菌 IgMを含む75 ml細胞培養上清(5 % FCS を含む)に0.5 M硫酸カリウム(終濃度)を添加
  • カラム: HiTrap IgM Purification カラム1 ml
  • 結合バッファー: 20 mM リン酸ナトリウム, 0.5 M 硫酸カリウム, pH 7.5
  • 溶出バッファー: 20 mM リン酸ナトリウム, pH 7.5
  • 洗浄バッファー: 20 mM リン酸ナトリウム, 30 % イソプロパノール, pH 7.5
  • 流速: 1 ml/min(156 cm/h)
表4-2

表4-2. 各画分の抗赤痢菌 IgM 活性分析(ELISA)

素通り画分にはIgM 活性はほとんど認められず、回収率はほぼ100 % でした。

図4-15

図4-15. 溶出画分のSDS-PAGE 分析

  • ゲル: PhastGel Gradient 4-15
  • システム: PhastSystem
  • 染色方法: 銀染色

  • レーン1: LMW マーカー
  • レーン2: 細胞培養上清、20 倍希釈
  • レーン3: ヒト IgM
  • レーン4: ヒト IgG
  • レーン5: 素通り画分、20 倍希釈
  • レーン6: 溶出画分(ピーク前半)、8 倍希釈
  • レーン7: 溶出画分(ピーク後半)、8 倍希釈
  • レーン8: 洗浄画分、3 倍希釈
図4-16

図4-16. ゲルろ過クロマトグラフィーによる溶出画分の分析

  • サンプル: 抗赤痢菌 IgM を含むHiTrap IgM Purification 溶出画分(250 μl)
  • カラム: Superdex 200 HR 10/30
  • 溶出バッファー: 20 mM リン酸ナトリウム, 0.15 M NaCl, pH 7.2
  • 流速: 0.5 ml/min(38 cm/h)

ゲルろ過クロマトグラフィーの結果より、純度80 % 以上のIgMがHiTrap IgM Purificationカラムによってワンステップで精製されていることが分かりました。

イオン交換クロマトグラフィーとゲルろ過クロマトグラフィーによる精製例

イオン交換クロマトグラフィーは、高い分離能を示すため複雑な成分の分離に非常に有効な精製方法です。ここではFCSを含むハイブリドーマ細胞培養上清からIgM を精製した例を紹介します。pH 5.0 以上でAlbuminは陽イオン交換カラムを素通りしますが、モノクローナルIgMは種類によってカラムに吸着する場合があります。非吸着成分を洗浄した後、塩濃度のリニアグラジエントでIgMを溶出しました。さらにIgMの分子量(900 kDa)が夾雑タンパク質に比べて大きいことを利用して、ゲルろ過クロマトグラフィーにより最終精製を行いました。
(Dr. H.F.J. Savelkoul, Erasmus University, Rotterdam, The Netherlands より提供のデータ)

精製操作

サンプル調製

ハイブリドーマ細胞培養上清(FCS含有)
活性炭(4 mg/ml)を添加し2 時間以上マグネティックスターラーで攪拌(フェノールレッドの除去)
遠心(10,000 × g、10 分間)
0.45μm フィルターでろ過

SP Sepharose FF による精製

Superdex 200 HR10/30 による精製

精製タンパク質

図4-17

図4-17. 陽イオン交換クロマトグラフィーによる1段階目の精製

  • サンプル: ヒトIgM を生産したハイブリドーマ細胞培養上清(FCS 含有)
  • カラム: SP Sepharose FF 担体をXK カラムに充填
  • 結合バッファー: 75 mM Tris-HCl, pH 8.0
  • 溶出バッファー: 75 mM Tris-HCl, 1.0 M NaCl, pH 8.0
  • グラジエント: 0 ~ 0.3 M NaCl, 10 CV(カラム体積 )
  • 流速: カラムの平衡化、サンプル添加 300 cm/h 溶出 30 cm/h
図4-18

図4-18. ゲルろ過クロマトグラフィーによる2段階目の精製

  • サンプル: SP Sepharose FF 担体からの溶出画分 0.2 ml
  • カラム: Superdex 200 HR 10/30
  • バッファー: 50 mM リン酸ナトリウム, 0.15 M NaCl, pH 7.8
  • 流速: 1.0 ml/min(76 cm/h)

※ モノクローナルIgM を高濃度のウシ胎児血清(FCS)を含むハイブリドーマ細胞培養上清から精製する場合には、電気泳動によりIgM の溶出位置を確認してください。

※ モノクローナルIgM の等電点は個々のIgM によって大きく異なるため、この条件で精製できるとは限りません。最適な純度と回収率を得るためには、ここに示された条件を目安にして結合条件の至適化を行ってください。


血清を添加した細胞培養液からの精製では、IgGが混入することに注意しましょう。精製純度をあげたい場合には、IgMの分子量が大きいことを利用し、ゲルろ過クロマトグラフィーを試してみるのが良いでしょう。

次回は、Yolk sac抗体IgYの精製プロトコールをご紹介します。


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