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抗体精製をマスターしよう (6)

ポリクローナルIgGの精製プロトコール

抗体精製イメージ今回からは、いよいよ実際の抗体精製プロトコールをご紹介です。今回は、研究分野で高い頻度で用いられている抗体であるポリクローナルIgGの精製がテーマです。第5回の「抗体精製に用いるカラム・ゲル担体」でご紹介した、カラム・ゲル担体を用いた実例もあります。ぜひ、ご参考になさってください。


ポリクローナルIgG の精製の前に

精製を始める前に、リガンドとカラムサイズの選択について、考えておきましょう。

リガンドの選択

ポリクローナルIgG は、抗原を動物に免疫して作製した抗血清から精製します。IgG とProtein AまたはProtein G との親和性は、動物種により異なります。第1回でご紹介した「図6 代表的な抗体クラスの生物学的性質」を参考にリガンドを選択してください。

本記事下部の、ポリクローナルIgG のアフィニティークロマトグラフィー精製例の項で、動物種ごとの親和性について触れていますので、こちらもご参照ください。

カラムサイズの選択

血清中のIgG 濃度は10 mg/ml を超えるので、血清量が多い場合は5 ml カラムを使用してください。

それでは、具体的なポリクローナルIgG精製のプロトコールを確認しましょう。

HiTrap 抗体精製カラムを用いた精製プロトコール

準備するバッファー

  • 結合バッファー: 20 mM リン酸ナトリウム, pH7.0
  • 溶出バッファー: 0.1 M クエン酸ナトリウム, pH 3.0~6.0 (HiTrap Protein A の場合)
              0.1 M グリシン-HCl, pH 2.7~3.0 (HiTrap Protein G の場合)
  • 中和バッファー: 1.0 M Tris-HCl, pH 9.0

Protein G はProtein A よりIgG との親和性が強いため、溶出バッファーの組成、pH が異なります。

【溶出条件】 Protein A: pH 3.0~6.0、Protein G: pH 3.0以下

サンプルの調製

1 ml カラムへの添加血清量の計算

おおよその血清中のIgG 濃度を 10 mg/ml として、カラムの最大結合容量から添加量を計算します。実際に添加するサンプル量は、その1/2 までにします。(最大添加量については下記リンク先をご参照ください。
→抗体精製をマスターしよう (5) 「結合容量とサンプル添加速度」の項

HiTrap カラムを連結することで、処理サンプル量を増やすことができます。

カラムの劣化を防ぐために、塩析法(下記リンクを参照)でサンプルを調製します。保存中に沈殿を生じる場合もあるので、添加直前に遠心分離(12,000 × g, 10 分)または0.45 µm フィルターでろ過してください。
→塩析法について:抗体精製をマスターしよう (4) 「サンプルの清澄化」の項

サンプル液量の増加は精製には影響しません。精製サンプル量が少ない場合には、結合バッファーで希釈(5~10 倍)してください。

HiTrap Protein G を用いた精製操作

カラムの準備

カラムに気泡を入れないように注意しながら、シリンジまたはシステムに接続5 ml の超純水を流速1 滴/ 秒(または1 ~ 2 ml/min)で送液

カラムの平衡化

3 ~ 5 ml の結合バッファーを流速1 滴/ 秒(または1 ~ 2 ml/min)で送液

サンプルの添加

調製したサンプル溶液を流速1 滴/ 2 秒(または0.2 ~ 1 ml/min)で送液

サンプルの添加流速が速すぎるとカラムを素通りすることがあります。

非吸着成分の洗浄

3 ~ 5 ml の結合バッファーを流速1 滴/ 秒(または1 ~ 2 ml/min)で送液

精製後にSDS-PAGE やEIA によってIgG が素通りしていないことを確認します。

抗体の溶出

溶出液を0.5 ml ずつ回収(回収チューブにはあらかじめ中和バッファー50 µl を添加)

溶出バッファーを流速1 滴/秒(または1~2 ml/min)で送液し、溶出液を0.5 ml ずつ回収(回収チューブにはあらかじめ中和バッファー50 µl を添加)

カラムに結合した抗体は、3 ml 以内に溶出します。

溶出画分の確認

精製IgG

バッファー交換

カラムの洗浄・保存

ポリクローナルIgG のアフィニティークロマトグラフィー精製例

原料となる抗血清中には、抗体のほかにAlbumin やTransferrin、リポタンパク質など様々な血清タンパク質が高濃度に存在します。イオン交換クロマトグラフィーは高い分離能と処理スピード、高吸着容量が特長で、タンパク質精製の初期段階で多用されています。しかし、血清が原料の場合には、これらの血清タンパク質もカラムに吸着するため、イオン交換クロマトグラフィーだけでは高純度の抗体を精製できません。

ここで紹介するProtein A やProtein G をリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィーは、これらのリガンドがIgG のFc 領域と強い親和性を持つことを利用した精製法で、IgG をワンステップで高純度に精製することができます。IgG のProtein A やProtein G に対する親和性は、動物種やサブクラスによって異なります。「代表的な抗体クラスの生物学的性質」を参考にして、適切なリガンドを選択してください。

マウス ポリクローナルIgG

マウスIgG はProtein A よりもProtein G の方が強く結合します。この例では0.3 ml のマウス血清からポリクローナルIgG をHiTrap Protein G 1 ml で精製しました。マウスIgG をProtein A カラムで精製する場合には、サンプルおよび結合バッファーの組成を変更する必要があります。(これらの組成については、後日ご紹介します)

図1 マウス ポリクローナルIgG の精製

試験管には前もって数滴の中和バッファーを入れておき、すぐに溶出画分の中和を行いました。

  • サンプル:PBS で10 倍希釈したマウス血清3 ml( 0.45 µm フィルターろ過処理)
  • カラム: HiTrap Protein G 1 ml
  • 結合バッファーA: 20 mM リン酸ナトリウム, pH 7.0
  • 溶出バッファーB: 0.1 M グリシン-HCl, pH 3.0
  • 中和バッファー: 1 M Tris-HCl, pH 9.0
  • 流速: 1.0 ml/min(156 cm/h)
図2

図2 溶出画分のSDS-PAGE分析(非還元)

ウサギ ポリクローナルIgG

ウサギIgG はProtein A やProtein G のどちらにも強い親和性を示します。1.3 ml のウサギ血清をサンプルとして、HiTrap Protein A 5ml で精製した例を示します。

図3

図3 ウサギ ポリクローナルIgG の精製

図4

図4 各画分のSDS-PAGE分析(非還元)

  • ゲル:PhastGel Gradient 10-15
  • 泳動システム:PhastSystem
  • 染色:銀染色
  • アプライ量:1 µl
  • 1:LMW分子量マーカー
  • 2:ウサギ血清(30倍希釈)
  • 3:Pool I 画分(10倍希釈)
  • 4:Pool II 画分(5倍希釈)

【精製の流れ】

5 ml の結合バッファーを送液後、サンプルを添加しました。

15 ml の結合バッファーで洗浄、10 ml の溶出バッファーで溶出を行いました(試験管には前もって数滴の中和バッファーを入れておき、すぐに溶出画分を中和しました)。

最後に5 ml の結合バッファーでカラムを再平衡化しました。

  • サンプル:1.3 ml のウサギ血清( 0.45 μmフィルターろ過処理)
  • カラム: HiTrap Protein A 5ml
  • 結合バッファーA: 20 mM リン酸ナトリウム, pH 7.0
  • 溶出バッファーB: 0.1 M クエン酸ナトリウム, pH 3.0
  • 中和バッファー: 1 M Tris-HCl, pH 9.0
  • 流速: 4.0 ml/min(119 cm/h)

ヒツジ ポリクローナルIgG の精製

ヒツジIgG はProtein A への結合が弱いのでより強い親和性を示すProtein G を選択します。ヒツジ IgG とProtein G の結合の強さについての詳細は「代表的な抗体クラスの生物学的性質」をご参照ください。2.5 ml のヒツジ血清からポリクローナルIgG をHiTrap Protein G 5 ml で精製した例を示します。

図5

図5 ヒツジ ポリクローナルIgG の精製

図6

図6 各画分のSDS-PAGE分析(非還元)

  • ゲル:PhastGel Gradient 10-15
  • 泳動システム:PhastSystem
  • 染色:銀染色
  • アプライ量:1 µl
  • 1:LMW分子量マーカー
  • 2:ヒツジ血清(10倍希釈)
  • 3:Pool I 画分(20倍希釈)
  • 4:Pool II 画分(5倍希釈)

【精製の流れ】

5 ml の結合バッファーを送液後、サンプルを添加しました。

15 ml の結合バッファーで洗浄、10 ml の溶出バッファーで溶出を行いました(試験管には前もって数滴の中和バッファーを入れておき、すぐに溶出画分を中和しました)。

最後に8 ml の結合バッファーでカラムを再平衡化しました。

  • サンプル:2.5 ml のヒツジ血清( 0.45 μmフィルターろ過処理)
  • カラム: HiTrap Protein G 5 ml
  • 結合バッファーA: 20 mM リン酸ナトリウム, pH 7.0
  • 溶出バッファーB: 0.1 M グリシン-HCl, pH 3.0
  • 中和バッファー: 1 M Tris-HCl, pH 9.0
  • 流速: 3.0 ml/min(90 cm/h)

マウス ポリクローナルIgG のサブクラス分離

図7

Protein A Sepharose CL-4B 担体を使用して、pH ステップグラジエントにより溶出し、マウス血清からサブクラスの異なるポリクローナルIgG を分離しました。マウス IgG1 とProtein A の親和性が弱い(通常pH 7.0 でも溶出がみられます)にもかかわらず、結合バッファーのpH と塩濃度を高くすることでProtein A カラムでも精製できるようになります。

(左)図7 サブクラスの分離

サンプルの溶出はpH 6.0, 5.0, 4.0 の3 種類の溶出バッファーを順番に送液して行いました。それぞれの溶出バッファーは、ピークが下がって安定するまで送液しました。

  • サンプル:マウス血清5 ml を結合バッファーで2 倍希釈し全量添加( 0.45 µmフィルターろ過処理)
  • カラム: Protein A Sepharose CL-4B をC 10/10 カラムに1 ml充填
  • 結合バッファーA: 1.5 M グリシン-NaOH, 3.0 M NaCl, pH 8.9
  • 溶出バッファーB: 0.1 M クエン酸ナトリウム, pH 6.0, 5.0, 4.0
  • 中和バッファー: 1 M Tris-HCl, pH 9.0
  • 流速: 0.8 ml/min(61 cm/h)

Protein A やProtein G を利用したアフィニティークロマトグラフィーにより、ワンステップでIgG を高純度に精製することができます。動物種やサブクラスを考慮したProtein A、Protein G の選択がポイントであることが、ご理解いただけたかと思います。

次回は、モノクローナルIgG の精製プロトコールをご紹介します。


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