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バイオダイレクトメール vol.25 Technical Tips
<タンパク質を大きさで分ける(3)-2 クロマトグラムの見方>

クロマトグラムのピークの形状は、ゲルろ過クロマトグラフィーのカラムパッキング状態を示す指標のひとつです。ここではクロマトグラムの見方や理想的なピーク形状についてご紹介してまいります。

ゲルろ過のピークの出方

ゲルろ過クロマトグラフィーの溶出パターン(クロマトグラム)の一例を図1に示しました。担体ポア内に入り込まない大きな分子はバッファーと同じ速度でカラムを通過するので排除体積(V0)またはその直後に溶出されます。適切に充填されたカラムの排除体積はおよそベッド体積の30%になります。担体内に入りこめる分子は大きいものから順に溶出されます(Technical Tips vol.23をご参照ください)。塩などの小さな分子は1カラム体積(Vt)のバッファーがカラムを通過する直前に溶出されます。

図1. ゲルろ過クロマトグラフィーの溶出パターン(クロマトグラム) 図1. ゲルろ過クロマトグラフィーの溶出パターン(クロマトグラム)
図1. ゲルろ過クロマトグラフィーの溶出パターン(クロマトグラム)

理想的なピーク形状

ピークが鋭く左右対称で、隣りのピークと離れているほど分離が良いクロマトグラムといえます(図2)。充填されているゲル担体の粒子径が細かいほど分離能は高くなります。同じかラムであればサンプル液量を減らし、流速を下げることで分離能を改善することができます(Technical Tips vol.24をご参照ください)。

図2. 分離能の良いクロマトグラムと悪いクロマトグラムの例
図2. 分離能の良いクロマトグラムと悪いクロマトグラムの例

ピーク形状が非対称の場合

排除体積より前にピークが伸びている場合(リーディングピーク)

リーディングピーク

ベッドに隙間ができている、あるいは担体が過度に充填されている(充填時の圧力や流速が高すぎる)可能性があります。カラムの再充填を行う必要があります。

後ろに引きずられているようなピーク(テーリングピーク)

テーリングピーク

このような場合はさまざまな要因が考えられます。

  • サンプルの添加が不適当な場合
  • サンプルが可溶化されていない場合
  • ベッドの上端が乱れており平らになっていない場合
  • 担体の充填が不十分な場合(充填時の圧力や流速が低すぎる)

※3回にわたってお届けしたゲルろ過クロマトグラフィー特集はいかがでしたか。次回より通常のTechnical Tipsをお届けします。

ゲルろ過クロマトグラフィーについてより詳しい情報はこちら
Chromatographyのインターナショナルサイトはこちら
ゲルろ過の原理について(Technical Tips vol.23) はこちら
ゲルろ過のサンプル調製について(Technical Tips vol.24) はこちら

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