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タンパク質精製のあとは??
HiTrap NHS-activated HP Columnsを用いたリガンドカップリング

HiTrap NHS-activated HP Columnsは、タンパク質やペプチド、DNAなどの生体分子をアミノ基を介して固定化(カップリング)し、任意のアフィニティーカラムを作製するカラムです。

  • リガンドの1級アミノ基を利用したカップリング反応
  • 15~30分(常温)と短時間で安定したカップリングが可能
  • スペーサーを介した活性エステルの導入により、低分子リガンドのカップリングも高効率
  • シリンジ送液によりカップリング処理が容易

HiTrap NHS-activated HP Columns

至適条件のpH 8.3では、 ε-アミノ基(リジン残基側鎖)はα-アミノ基(N末端アミノ酸)よりも優先的に反応し、15~30分で反応が完了します。反応基のカルボキシル基はN-hydroxysuccinimide(NHS)により活性エステル化されており、リガンド溶液を注入するだけでリガンドの1級アミノ基(-NH2)とアミド結合を形成します。
NHS-activated担体とリガンド分子の反応
リガンド分子と結合した状態(下)がエネルギー的に有利であるため、リガンド分子を加えるだけで反応が進行します。

リガンド溶液に1級アミノ基を持つ物質が混入しているとカップリング効率は著しく低下します。必ず脱塩カラムなどを利用してアミノ基を含まないバッファーに交換してください。

HiTrap NHS-activated HP カラムのカップリングプロトコール

1 mlカラムを用いたタンパク質やペプチドのカップリングプロトコールをご紹介します。5 mlカラムの場合は、液量、流速を5倍にしてください。

準備するバッファーおよび溶液

バッファーは高純度の試薬、超純水で調製し、使用する前に0.45 µmフィルターでろ過してください。

カラム洗浄液 1 mM HCl(氷冷)
カップリングバッファー 0.2 M 炭酸水素ナトリウム, 0.5 M NaCl, pH 8.3
ブロッキングバッファー 0.5 Mモノエタノールアミン, 0.5 M NaCl, pH 8.3
洗浄バッファー 0.1 M 酢酸ナトリウム, 0.5 M NaCl, pH 4.0
平衡化バッファー リガンドと目的タンパク質が安定に結合するバッファーを選択します。結合に金属イオンや補酵素などの添加物が必要な場合には、平衡化バッファーにも添加してください。

リガンド溶液の調製

一級アミノ基含有化合物の除去
カップリング効率の低下を防ぐため、リガンド溶液中に1級アミノ基(-NH2)を含む化合物が存在する場合は、PD-10やHiTrap Desaltingカラムなどを用いて、指定のカップリングバッファーに交換してください。
カップリングするリガンド量
タンパク質の場合は、濃度を 0.5~10 mg/mlに調製します。
リガンド溶液の体積
カラム体積と同量のリガンド溶液をシリンジで注入します。リガンド溶液がカラム体積より多い場合には、2本のシリンジをカラムの両側に取り付けて交互に送液するか、ペリスタルティックポンプを接続してリガンド溶液をカラムに循環させます。
リガンドの溶解性
リガンドの溶解度が低い場合は、8 Mウレアや6 M塩酸グアニジン、界面活性剤などを用いて完全に溶解してからカラムに注入してください。
※変性剤を添加するとリガンドの立体構造が不可逆的に変化して、目的タンパク質が結合できなくなることがあるので、変性剤の使用には注意が必要です。保存中に沈殿を生じることもあるので、カラムに注入する直前に遠心(12,000×g、10分)または0.45 µmフィルターでろ過して不溶物を除去してください。

カップリングの手順

HiTrap 1 mlカラムのプロトコールです。5 mlカラムを使用する場合は、流速およびバッファー使用量を5倍にしてください。

  1. カラムの準備
    1. カラムに気泡を入れないように注意しながら、シリンジを接続
    2. 5 mlの1 mM HClを、流速1滴/秒(または0.2 ~ 1 ml/min)で送液
      1 mM HCl送液後、すぐにリガンド溶液をカラムに添加してください。リガンド溶液添加の前に蒸留水でHCl を除去する必要はありません。
  2. カップリング反応
    1. 1 ml のリガンド溶液を、流速1滴/秒(または0.2~1 ml/min)で送液
    2. カラム出口を付属のストッププラグで密閉し、室温で15~30分間、または4℃で4時間放置
    3. 3 mlのカップリングバッファーを、流速1滴/秒(または0.2~1 ml/min)で送液
  3. 未反応活性基のブロッキング
    1. 6 mlのブロッキングバッファーを流速1滴/秒(または1~2 ml/min)で送液
    2. 6 mlの洗浄バッファーを流速1滴/秒(または1~2 ml/min)で送液
    3. 6 mlのブロッキングバッファーを流速1滴/秒(または1~2 ml/min)で送液、室温で15~30分間、または4℃で4時間放置
  4. カラムの洗浄と平衡化
    1. 6 mlの洗浄バッファーを流速1滴/秒(または1~2 ml/min)で送液
    2. 6 mlのブロッキングバッファーを流速1滴/秒(または1~2 ml/min)で送液
    3. 6 mlの洗浄バッファーを流速1滴/秒(または1~2 ml/min)で送液
    4. 平衡化バッファーを流速1滴/秒(または1~2 ml/min)で送液
  5. リガンド固定カラム作製完了

リガンド固定化アフィニティーカラムによる精製例

→→→以下の精製例の詳細はこちらの「はじめてのリガンドカップリングハンドブック」の抜粋(PDF:410KB)をご覧ください。

抗体固定カラムを用いた抗原の精製

抗BSA(ウシ血清アルブミン)ポリクローナルIgGを固定したカラムを使用して、1回の操作でウシ胎児血清から高純度なBSAを精製しました。

抗原固定カラムを用いた特異抗体の精製

マウスIgGを固定したカラムを使用して、抗マウスIgGを精製しました。

より高純度の抗体を得るために!

抗血清をそのままリガンド溶液としてカップリングカラムに添加するのではなく、Protein A/Protein GカラムによってIgGを精製し、それを抗原固定カラムに添加する2段階の方法も可能です。これにより、より高純度の抗体を得ることができる他、カラムの劣化を防ぐことができます。


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