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お客さまレビュー/データ紹介 illustra TempliPhi DNA Amplification Kit

シークエンシング テンプレート調製試薬
illustra TempliPhi DNA Amplification Kit

illustra TempliPhi DNA Amplification Kit は、Rolling Circle Amplification(RCA)法という特異的な増幅サイクルによりDNA増幅を行う試薬です。プラスミドなどのシークエンシング反応用環状DNAを、Taq ポリメラーゼの約100倍の校正(エラー率:1×107)で増幅することができます。

→illustra TempliPhi DNA Amplification Kit のご注文情報

【お客さまレビュー】 1件

コメントをいただいたお客さま 独立行政法人N研究機構 研究員 K様 ご感想

TempliPhiは大変重宝しております。私はDNAメチル化の研究をしておりまして、バイサルファイトPCRというメチル化を検出するための実験をするために、数十~数百のシーケンスをしなければなりません。今までは頑張ってミニプレップしていましたが、数年前にTempliPhiを知ってからは、その手間が大幅に減りました。大変感謝しております。大腸菌のコロニーを爪楊枝でつっついて、PCRチューブで反応すればプラスミドDNAだけが増幅されるので(4時間~オーバーナイト)、これで何十クローンも簡単にシーケンスに回せます。(さらに、ナイショですが、半量系以下でも動いちゃったりします・・・。

弊社推奨の使用方法を個別に検討・改善された実験手法をご参考にされる場合は、お客さま各位の責任において実施していただきますようお願い申し上げます。

製品使用時の満足度 ★★★★★
使用目的 バイサルファイトPCRによるDNAメチル化解析

※お客さまの使用経験に基づく記載です。


【データ紹介】 3件

※これらのデータは旧型製品で得られたデータ紹介例であり、現在は改良型のキットが販売されています。プロトコール等が異なりますので、紹介例は参考結果としてご参照ください。詳細につきましては、バイオダイレクトライン(03-5331-9336)までご連絡ください。


福間先生フォト

久留米大学 医学部 寄生虫学講座
福間 利英 先生、井上 雅広 先生、安田 幸一 先生

TempliPhi DNA Amplification Kit の良いところ
  • プラスミドのコピー数が培養でほとんど増えないものでも増やす事ができた
  • 出発材料がバクテリアコロニーでもプラスミド溶液でも同じように使用できる
目的

アフリカトリパノソーマ原虫に対する治療薬のターゲットとなる蛋白変異体の作成

使用機器・試薬
  • シークエンサー:ABI PRISM 310
  • シークエンシング反応試薬:BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit
  • TempliPhi反応装置:PCR装置 (GeneAmp 2400)
  • TempliPhiキットの種類:TempliPhi 100 DNA Amplification Kit*

* 旧型製品になります。現在はillustra TempliPhi 100 DNA Amplification Kitです。

実験方法
  • TempliPhi 100 DNA Amplification Kit 反応
    1. 1mm程度のコロニーに爪楊枝をの先をつけ、一部をピックアップ
    2. Sample Buffer 5 µl に加え、95℃で3分間熱変性する
    3. Reaction Buffer 5 µl とEnzyme mix 0.2 µl を混ぜたプレミックスから5 µl を上記サンプルに加える
    4. 30℃で4時間反応後、65℃で10分間
  • シークエンシング反応
    TempliPhi 増幅産物 2 µl
    プライマー 3.3 pmol

    上記サンプルをBigDye(R) Terminator Cycle Sequencing Kit ver3を使用して下記のサイクル条件で反応した。

    96℃ 10 sec
    50℃ 5 sec 25サイクル
    60℃ 4 min
    4℃ soak
  • 泳動

    シークエンシング反応後、AutoSeq G-50 カラムにて精製し、シークエンサーにセットした。

結果

プラスミドプレップキットを使用した場合と比較しても同等の結果がでた。シグナル強度は従来法より高くなった。また、従来法では増えなかったプラスミドについてもこれと同様の良好な結果が出ている。 (下記画像をクリックすると拡大表示されます)

TempliPhi結果のシークエンスデータ
TempliPhi結果

プラスミドプレップ結果のシークエンスデータ
プラスミドプレップ結果

※お客さまの使用経験に基づく記載です。


小原先生フォト

かずさDNA研究所 ヒト遺伝子第一研究室
小原 收 先生

TempliPhi DNA Amplification Kit の良いところ
  • 菌液からシークエンシスの鋳型が調製できるので、手間・時間がかからない
  • うまく反応が進んでいると液の粘性が上がるので、わかりやすい
  • 反応系が単純なので、特にサンプルが多いときには便利
目的

プラスミド cDNA クローンのシークエンシング

使用機器・試薬
  • シークエンサー:RISA-384システム
  • シークエンシング反応試薬:DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit
  • TempliPhi反応装置:インキュベーター
  • TempliPhiキットの種類:TempliPhi 10000 DNA Amplification Kit*

* 旧型製品になります。現在はillustra TempliPhi HT DNA Amplification Kitです。

実験方法
  • TempliPhi 10000 反応
    1. 液体培地をdH2Oで1/5倍希釈
    2. Denature buffer 10 µlに加え、95℃で3分間熱変性する
    3. TempliPhi PreMix 10 µlを上記サンプルに加える
    4. 30℃で16時間反応後、95℃で5分間
  • シークエンシング反応

    TempliPhi 増幅産物を1/2倍に希釈したものを2 µlを鋳型に、Primer 3 pmole を使用し、DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit にて下記のサイクル条件で反応した。

    [PCRサイクル条件]

    96℃ 15 sec
    50℃ 10 sec 60 サイクル
    60℃ 1 min
    4℃ soak
  • 泳動

    シークエンシング反応後、Millipore社Multiscreenカラムにて精製し、シークエンサーにセットした。

    なお、弊社のスタンダードプロトコールにつきましては、こちら(PDF:27KB)をご覧ください。

結果

(下記画像をクリックすると拡大表示されます)
シークエンスデータ
マグネティックビーズを使用したプラスミド精製ロボットで精製したプラスミドと、同等の精度でシークエンシングすることができた。

※お客さまの使用経験に基づく記載です。


青森県グリーンバイオセンター 細胞工学研究部 青い花開発プロジェクトチーム
各務 孝 先生

TempliPhi DNA Amplification Kit の良いところ
  • サンプルにチップを入れる回数が少なく、誰が利用しても事故が起こりにくい
  • マルチピペットとPCR装置だけで、自動化ロボットなみの仕事が可能
  • シグナル強度が均一
目的

植物の色素生合成系遺伝子の単離

使用機器・試薬
  • シークエンサー:ABI PRISM 3100 / 373
  • シークエンシング反応試薬:BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit ver.3
  • TempliPhi反応装置:GeneAmp 9700
  • TempliPhiキットの種類:TempliPhi 100 DNA Amplification Kit*

* 旧型製品になります。現在はillustra TempliPhi 100 DNA Amplification Kitです。

実験方法
  • TempliPhi 100 反応
    1. プレート上のコロニーをチップ先で突きピックアップし、TE バッファー(pH8.5)に懸濁
    2. Sample buffer 5 µl に加え、95 ℃で3分間熱変性する
    3. Reaction Buffer 5 µl とEnzyme mix 0.2 µl を混ぜたプレミックスから5 µl を上記サンプルに加える
    4. 30 ℃で6時間反応後、65 ℃で10分間
  • シークエンシング反応
    TempliPhi 増幅産物 3 µl
    Primer 3.2 pmole

    上記サンプルをBigDye Terminator Cycle Sequencing Kit ver3を使用して下記のサイクル条件で反応した。

    [PCRサイクル条件]

    96℃ 10 sec
    50℃ 5 sec 25サイクル
    60℃ 4 min
    4℃ soak
  • 泳動

    シークエンシング反応後、エタノール沈殿を行い、ローディングバッファーを加えて、シークエンサーにセットした。

結果

(下記画像をクリックすると拡大表示されます)
シークエンスデータ
上図はABI PRISM 3100のデータだが、ABI Model 373を使用した場合も、問題なくシークエンシングデータ-を得ることができた。

※お客さまの使用経験に基づく記載です。


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