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AKTAの簡単便利機能講座【8】
~もっと簡単にバッファーpHの検討をしませんか~

イオン交換でサンプルを分離するポイントとして

  • カラム(イオン交換基、担体の粒子径)の選択
  • グラジエントのかけ方
  • 流速
  • バッファーのpH

などがあります。

それぞれのタンパク質は固有の等電点をもち、下図のようにpHを変化させると電荷状態が変わります。イオン交換でより良い分離を目指すにはバッファーpHの変更は非常に有用な条件検討項目です。 多くの条件を試すことで、より良い条件が発見できる可能性が高まりますが、一方pHの異なるバッファーを数多く用意しなければいけないため、条件検討の準備作業で大変な手間がかかります。

その手間をできる限り減らしていただくためにAKTAexplorerやAKTApurifierには自動バッファー調製機能(BufferPrep機能)が搭載されています。今回はその機能を紹介します。

滴定曲線
図. タンパク質の有効表面電荷とpHの相関を示した滴定曲線の模式図およびクロマトグラフィーの分離パターン
横軸はpHを示し縦軸はタンパク質の表面電荷を示します。上部の分離パターンは各pH条件下で陽イオン交換体を用いて-精製した時のクロマトグラム、下部は陰イオン交換体で精製した時の分離パターンを示します。目的のタンパク質が分離しているか、収量、安定性はどうかという観点から適した条件を選びます。

※ UNICORN 5.11の設定に沿って記載していますが、ご使用の機種やUNICORNバージョンによって表記が異なる場合があります。
※AKTApurifierはご使用の機種により、本機能がオプションとなっている場合があります。BufferPrep Kitを取り付けていただくことにより、本機能をご利用いただけます。

 

BufferPrep機能を利用した条件検討のすすめ方

インレット図

インレットの準備

A1:バッファー(Conc)
A2:0.1 M HCl(または0.1 M NaOH)
B1:超純水
B2:2 M NaCl


2液を使用する通常のクロマトグラフィーでは使用しないA2、B2のラインの準備が必要です。各機種のマニュアルに従って、パージ操作とPump Wash操作を忘れずに行ってください。

BufferPrepでは、上記の4液のみで各バッファーの緩衝能の範囲でpH形成が可能です。コンピュータから目的のpHを入力すると、AKTAが自動的に4液の混合を実行してオンラインでバッファー調製します。 なお、本機能ではプログラムされた混合比率に基づいて4液の混合が行われます。実際のpHは、pHモニターにてオンライン測定されますので画面上にて現時点のpHを確認できます。

 

メソッドの作成

メソッドエディターのウィザードにてメソッドを作成します。最初のMain Selectionのページにある「BufferPrep」のチェックボックスにチェックを入れると、「BufferPrep Recipe」で使用するバッファーの選択と、「BufferPrep pH」で実験するpHの入力が可能になります。以降のページでは通常どおりメソッドを作成します。

メソッドエディター

 

スカウティング設定

作成したメソッドのScoutingタブをクリックすると、Scouting Variablesウィンドウが表示されます。「BufferPrep pH」にチェックを入れ、OKボタンをクリックします。Frac-950で分取する場合は、「Show details」にチェックを入れ、素通り画分については「Flowthrough StartAt」に、溶出画分については「1 Start at(または「Elute Frac Start at」)」にチェックを入れます。

スカウティング バリアブルウインドウ1

評価したい実験回数になるようにAddボタンをクリックします。ラン毎にpHの値を入力します。 Scoutingでは、指定したパラメータだけを変えて指定回数の実験を行いますので、Frac-950でフラクションを回収する場合は、忘れずに2ラン目以降の素通り画分の回収開始ポジションである「Flowthrough StartAt」、および溶出画分回収開始ポジション「1 Start at(またはElute Frac Start at)」の設定を「Next tube」となるよう設定し、すべてのRunでフラクションを別回収できるようにします。 設定できたら、File↓Save as…でメソッドを保存してください。

スカウティング バリアブルウインドウ2

 

バッファー組成の確認と調製

メソッドを完成させ、BufferPrepのタブをクリックすると、使用するバッファー組成のレシピが表示されます。このレシピに従ってバッファーを調製します。一般的なバッファー調製と異なり、濃縮バッファーのpH滴定は不要です。

スカウティング バリアブルウインドウ2

 

pH電極の校正

pH標準液を用い、2点校正を行います。手順はこちらをご参照ください。

 

サンプルの準備

実行するすべてのpH条件でサンプルがカラムに吸着するように調製します。 具体的には、 陰イオン交換では検討したいpH範囲よりも塩基性pHのバッファーで、 陽イオン交換では検討したいpH範囲よりも酸性側pHのバッファーでサンプルを調製します。

 

メソッドの実行

あとは待つだけ!pH条件検討はAKTAに任せて、他のお仕事ができます。 1 Runあたりにどのくらいの時間がかかるかは、メソッドの「method information」タブの「method duration」にて確認できます。

 

リザルトファイル

リザルトファイルはクロマトグラム型のフォルダーの内に保存されます。

リザルトファイル

複数のリザルトファイルのカーブを同一ウィンドウで表示させるCompare機能を使うと、カーブの比較が容易になります(File↓Open to compare)。

 

いかがでしたか?
これまでpH 条件検討で苦労されたかたも、これから検討する予定というかたにもぜひおすすめしたい機能です。

 

 

体験しませんか?

検討するpH数が多くなるほど本機能の利便性が体感できます。AKTAユーザートレーニングではBufferPrepの操作をトレーニングします。やってみたいけど、始めるにはちょっと不安、というかたはユーザートレーニングに参加してみませんか? AKTAユーザートレーニングは、東京会場、大阪会場にて毎月交互に開催しています。 2日間みっちりとpHスカウティングを含むAKTAの機能を体験し、しっかり身に付けられるコースです。

AKTAユーザートレーニングの詳細はこちら


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