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細胞溶解液・生体液から目的タンパク質を手軽に濃縮・回収できるサンプル調製キット
Protein G/A HP SpinTrap

新製品Protein G HP SpinTrapおよびProtein A HP SpinTrapは、Protein G/A 結合セファロース担体にお手持ちの抗体を結合させることで、多数サンプルからの目的タンパク質の迅速な濃縮・回収(免疫沈降)を可能にする便利なキットです。通常のプロトコールに加え、抗体をセファロース担体に固定化するクロスリンクプロトコールを用意していますので、抗原のみを特異的に回収することができます。


● スモールスケールの濃縮・回収に最適なリガンドカップリング型プレパックカラム
● すばやく結合し、結合容量が多いため高回収率を実現
● 回収サンプルを電気泳動やLC-MS などで使用できるよう、プロトコールを最適化
● 標準的プロトコールおよびクロスリンクプロトコールの2種類を選択可能

2種類のプロトコールを選択可能(標準プロトコール・クロスリンクプロトコール)

Protein G HP SpinTrapProtein A HP SpinTrapは、抗体を用いて効率的に目的タンパク質(複合体)のみを回収することができます。Protein G/A HP SpinTrapには、抗体と抗原を同時に溶出する標準プロトコールと、抗体をセファロース担体に固定化して抗原だけを溶出するクロスリンクプロトコールの2種類があります。図1は、2つのプロトコールの模式図です。

標準プロトコール

標準プロトコールは、(1)担体の平衡化(2)抗体の結合(3)サンプル添加・洗浄(4)目的タンパク質の溶出の順番で進めます。このプロトコールでは、抗体が目的タンパク質とともに溶出されます。目的タンパク質とIgGとの分子量差が大きい場合では、抗体が共に溶出されても悪影響は少なく、標準プロトコールで十分なケースもあるでしょう。また、必要に応じてタンパク質サンプルを蛍光色素(CyDyeなど)やラジオアイソトープにより目的タンパク質を標識することで、抗原のみを検出することができます。なにより、手早く効率的に回収できることがメリットです。

クロスリンクプロトコール

抗体-Protein G/Aの結合を架橋化剤により恒久化し、抗体が抗原とともに溶出されることを防ぎます。したがって、抗原のみ溶出させたい場合は、クロスリンクプロトコールを用います。プロトコールに架橋のステップが加えられることになりますが、目的タンパク質を特異的に回収できることがメリットです。電気泳動後やLC-MSによるタンパク質同定を考えている場合では、IgGが含まれていると同定効率が下がることが予測されますので、クロスリンクプロトコールを選択することが望ましいです。

クロスリンクプロトコールでは、抗体の架橋ステップが入ります

図1 標準的プロトコールとクロスリンクプロトコールの模式図

高い回収率・再現性を実現

Protein G HP SpinTrapを用いた実験データを示します。標準プロトコールと蛍光標識を組み合せた例を図2に、クロスリンクプロトコールを用いた例を図3に示しました。どちらもは操作がシンプルで、時間をかけずに高い回収率(平均80%)で目的タンパク質を濃縮できます。クロスリンクプロトコールでは抗体が溶出しないため、目的タンパク質を高純度で回収することができます。

SDS-PAGEの蛍光擬似カラーイメージ

図2 標準プロトコールによるHSAの濃縮

Cy3標識した大腸菌ライセートに0.15%量のCy3/Cy5の双方で標識したHSAを添加したサンプルから、Protein G HP SpinTrapを用いてHSAを回収し、SDS-PAGEを行いました。HSAを効率よく回収できたことが示されました。また、抗原と共に溶出されている抗体は蛍光標識をしていないため、泳動パターン上では示されていません。
各レーンのサンプル(1:精製ヒト血清アルブミン(HSA, Cy5標識)、2:カラム素通り(1/30)、3:洗浄1回目(1/10)、4:洗浄3回目、5:洗浄5回目、6:溶出1回目、7:溶出2回目、8:溶出3回目)
検出:Ettan DIGE Imager
※Cy3(赤)、Cy5(緑)で示されています

SDS-PAGEイメージ3回試行における回収率のばらつき

図3 クロスリンクプロトコールによるトランスフェリンの濃縮

大腸菌ライセートからProtein G HP SpinTrapを用いてトランスフェリンを回収し(3サンプル・各3回溶出)、SDS-PAGEで純度と回収量を比較しました。

A)各ステップにおける含有タンパク質の検証
プロトコールのステップごとにサンプリングを行い、SDS-PAGEによって解析しました。
各レーンのサンプル(1:精製ヒトトランスフェリン(1.5μg)、2:カラム素通り(1/30)、3:洗浄1回目(1/10)、4:洗浄3回目、5:洗浄5回目、6:溶出1回目、7:溶出2回目、8:溶出3回目、9:分子量マーカー)
染色:DeepPurple Total Protein Stain Kit、検出:Ettan DIGE Imager

B)回収率の再現性
出発サンプル中の量を元にトランスフェリンの回収量を%で表し、3サンプル間で比較しました。1回目の溶出ステップで大部分の回収ができていることと、各試行で再現性良くトランスフェリンを回収できていることが明らかになりました。

まとめ

目的タンパク質の濃縮・回収は、電気泳動・LC-MS ・クロマトグラフィーなどさまざまなタンパク質解析手法の前段階で必要となる重要な実験プロセスです。特に、病態や治療法の解析など多数サンプルのプロテオミクス解析を行う場合は、簡単な実験操作ですぐれた再現性を維持することが大切です。Protein G/A HP SpinTrapは、手早いプロトコールと再現性に優れており、これらの研究に最適なパフォーマンスを発揮できる免疫沈降キットです。

●ストレプトアビジン・NHSタイプをラインナップ
Protein G/Aのほか、ビオチンとストレプトアビジンの強固な相互作用によってカップリングするStreptavidin HP SpinTrap、NHS(N-ヒドロキシスクシンイミド)とリガンドのアミノ基のアミド結合によってカップリングするNHS HP SpinTrapをラインナップしています。

●96ウェルプレートでハイスループット対応
自動化・ハイスループットにも対応可能な96ウェルプレートタイプ(MultiTrap)もございます。

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