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抗体精製をマスターしよう (7)

モノクローナルIgGの精製プロトコール

抗体精製イメージ前回に引き続き、抗体精製プロトコールをご紹介します。

今回は、モノクローナルIgGの精製についてご紹介します。第6回でご紹介した「ポリクローナルIgG の精製プロトコール」と同様に、Protein G/A を用いたアフィニティークロマトグラフィー精製が基本です。今回はそれに加えて、不安定な抗体を精製する際に有用であるイオン交換クロマトグラフィーを用いた精製プロトコールと、精製例についても解説いたします。

大部分のモノクローナルIgG は、アフィニティー精製でOK

モノクローナルIgG 精製にはProtein G が最適

ポリクローナル抗体の精製時と同様に、リガンドについて考えておきましょう。

リガンドの選択

マウスで作製されるモノクローナルIgG は、腹水またはハイブリドーマ細胞培養上清を材料として精製します。マウス由来のモノクローナルIgG は、Protein A よりもProtein G に強い親和性を示すため、精製に用いるアフィニティー担体としてはProtein G をお奨めします。

他の動物種の場合は、第1回でご紹介した「図6 代表的な抗体クラスの生物学的性質」を参考にリガンドを選択してください。

結合が弱い抗体、酸に不安定な抗体の場合にはイオン交換クロマトグラフィー疎水性相互作用クロマトグラフィーで精製します。

それでは、具体的なモノクローナルIgG 精製のプロトコールを確認しましょう。

HiTrap Protein Gを用いたアフィニティー精製プロトコール

準備するバッファー

  • 結合バッファー: 20 mM リン酸ナトリウム, pH7.0
  • 溶出バッファー: 0.1 M グリシン-HCl, pH 2.7~3.0 (HiTrap Protein G の場合)
  • 中和バッファー: 1.0 M Tris-HCl, pH 9.0

サンプルの調製

HiTrap Protein G 1 ml カラムへの添加腹水量の計算

腹水中には1~15 mg/ml のIgG が含まれています。初回の精製では、5~10 mg IgG を目安としてサンプルを準備し、カラムを選択してください。カラムへの最大添加量については、下記リンク先をご参照ください。
→抗体精製をマスターしよう (5) 「結合容量とサンプル添加速度」の項

(下記はポリクローナル抗体精製時と同様)
カラムの劣化を防ぐために、塩析法(下記リンクを参照)でサンプルを調製します。保存中に沈殿を生じる場合もあるので、添加直前に遠心分離(12,000 × g, 10 分)または0.45 µm フィルターでろ過してください。
→塩析法について:抗体精製をマスターしよう (4) 「サンプルの清澄化」の項

サンプル液量の増加は精製には影響しません。精製サンプル量が少ない場合には、結合バッファーで希釈(5~10 倍)してください。

HiTrap Protein G と用いた精製操作

HiTrap Protein G を用いた精製操作は、ポリクローナル抗体精製時と同じです。リンク先をご参照ください。
→抗体精製をマスターしよう (6) 「HiTrap Protein G を用いた精製操作」の項

モノクローナルIgG のアフィニティークロマトグラフィー精製例

原料となる腹水やハイブリドーマ細胞培養上清は、IgG 以外のタンパク質をほとんど含みません。そのためProtein A やProtein G をリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィーにより、ワンステップで高純度な抗体を精製することができます。また、IgG は濃縮して溶出されることからハイブリドーマ細胞培養上清のように大量の原料からモノクローナル抗体を精製する場合において、最も好まれている精製手法の1 つです。

ポリクローナルIgG の精製と同様に、動物種やサブクラスによってProtein A とProtein G に対する親和性が異なりますので担体を使い分けます。抗体とProtein A またはProtein G の親和性の詳細は、第1回でご紹介した「図6 代表的な抗体クラスの生物学的性質」 をご参照ください。

マウス モノクローナルIgG

10 ml のマウスハイブリドーマ細胞培養上清から抗EPO(EPO:Erythropoietin)モノクローナルIgG2b を、MAbTrap Kitで精製した例を紹介します。精製はキットに付属のシリンジを使ったマニュアル操作とペリスタルティックポンプによる操作の両方で行いました。方法によって回収量に差は認められないことがわかります。

図1

図1 マウス モノクローナルIgG2b の精製(ポンプ使用)

試験管には前もって数滴の中和バッファーを入れておき、すぐに溶出画分の中和を行いました。

  • サンプル:マウスハイブリドーマ細胞培養上清(10 ml)
  • カラム: HiTrap Protein G 1 ml
  • 結合バッファー: MAbTrap Kit 結合バッファー(10倍希釈して使用)
  • 溶出バッファー: MAbTrap Kit 溶出バッファー(10倍希釈して使用)
  • 中和バッファー: MAbTrap Kit 中和バッファー
  • システム: ペリスタルティックポンプ
  • 流速: 2.0 ml/min(312 cm/h)
図2

図2 各画分のSDS-PAGE分析(非還元)

  • ゲル:PhastGel Gradient 10-15
  • 泳動システム:PhastSystem
  • 染色:銀染色
  • アプライ量:1 µl
  1. LMW分子量マーカー
  2. マウスハイブリドーマ細胞培養上清(11倍希釈)
  3. 素通り画分(10倍希釈、ペリスタルティックポンプ使用)
  4. 溶出画分(3倍希釈、ペリスタルティックポンプ使用)
  5. 素通り画分(3倍希釈、シリンジ使用)
  6. 溶出画分(3倍希釈、シリンジ使用)

【精製の流れ】

5 ml の結合バッファーを送液後、サンプルを添加しました。

7 ml の結合バッファーで洗浄、5 ml の溶出バッファーで抗体を溶出しました(試験管には前もって75 µlの中和バッファーを入れておき、すぐに溶出画分を中和しました)。

最後に5 ml の結合バッファーでカラムを再平衡化しました。

ヒト化 モノクローナルIgG4

血清を含むハイブリドーマ細胞培養上清(30 ml)から11.2 mg のモノクローナルIgG4HiTrap rProtein A で精製した例を紹介します。

リガンドの rProtein A は、天然型Protein A のalbumin 結合領域を遺伝子工学的に除去して大腸菌で生産した組換え体タンパク質です。血清を含むハイブリドーマ細胞培養上清や抗血清からの抗体精製で威力を発揮します。SDS-PAGE の結果、サンプル中に含まれるalbumin は素通りし、溶出画分のIgG4 の純度は95 % 以上(SDS-PAGE)であることがわかりました。回収率は93 % でした。

※サンプルはDr. J. Bonnerjea, LONZA Biologics plc, UK より寄贈いただきました

図3

図3 ヒト化モノクローナルIgG4 の精製

サンプルを添加後、10 ml の結合バッファーで洗浄、5 ml の溶出バッファーで溶出しました。

  • サンプル:12 mg ヒト化モノクローナルIgG4 を含む30 ml のハイブリドーマ細胞培養上清 (0.45 µm フィルター処理)
  • カラム: HiTrap rProtein A 1 ml
  • 結合バッファー: 20 mM リン酸ナトリウム, pH 7.0
  • 溶出バッファー: 0.1 M クエン酸ナトリウム, pH 3.0
  • 中和バッファー: 1 M Tris-HCl, pH 9.0
  • 流速: 1.0 ml/min(156 cm/h)
図4

図4 溶出画分のSDS-PAGE分析(非還元)

  • ゲル:PhastGel Gradient 10-15
  • 泳動システム:PhastSystem
  • 染色:銀染色
  • アプライ量:1 µl (各サンプルを15 % SDS, 60 mM Tris, 6 mM EDTA, 0.06 % Bromophenol Blue, pH 8.0 で5倍希釈)
  1. LMW分子量マーカー
  2. ハイブリドーマ細胞培養上清
  3. 素通り画分
  4. 溶出画分

ラット モノクローナルIgG の精製

ラットのIgG はProtein A には結合しないので、Protein G で精製します。10 ml のラット ハイブリドーマ細胞培養上清から抗CD4 モノクローナルIgG2bProtein G Sepharose 4FF 担体で精製しました。

図5

図5 ラット モノクローナルIgG の精製

  • サンプル:ラットハイブリドーマ細胞培養上清(25 ml)
  • カラム: Protein G Sepharose 4FF (1×1.2 cm)
  • 結合バッファー: 20 mM リン酸ナトリウム, pH 7.0
  • 溶出バッファー: 0.1 M グリシン-HCl, pH 2.7
  • 中和バッファー: 1 M Tris-HCl, pH 9.0
  • 流速: 0.8 ml/min(61 cm/h)
図6

図6 溶出画分のSDS-PAGE分析(非還元)

  • ゲル:PhastGel Gradient 10-15
  • 泳動システム:PhastSystem
  • 染色:銀染色
  1. LMW分子量マーカー
  2. 細胞培養上清
  3. 溶出画分(0.16 µg)

酸性条件に不安定なモノクローナルIgG の精製

イオン交換クロマトグラフィーを用いたモノクローナルIgG 精製プロトコール

Protein G やProtein A を使用した抗体のアフィニティー精製では、溶出に酸性バッファーを使用するため抗体が失活する危険性があります。このような酸に不安定な抗体の場合には、中性付近のバッファーで精製するイオン交換クロマトグラフィーが適しています。

ここでは、HiTrap イオン交換 1 ml カラムの場合のプロトコールをご紹介します。5 ml カラムを使用する場合は、流速およびバッファー使用量を5 倍にしてください。

準備するバッファー

陰イオン交換体(Q, DEAE)
  • 開始バッファー: 20 mM Bis-Tris propane, pH 9.5
  • 溶出バッファー: 20 mM Bis-Tris propane, 1 M NaCl, pH 9.5
陽イオン交換体(S, SP, CM)
  • 開始バッファー: 50 mM MES, 20 mM NaCl, pH 6.0
  • 溶出バッファー: 50 mM MES, 1 M NaCl, pH 6.0

サンプルの調製

イオン交換担体はProtein A やProtein G よりも大きな吸着容量があります。大量に添加すると溶出時の抗体濃度が高くなり、凝集することがあるため、カラムへの添加量は10 mg程度までとします。

サンプル中の不純物や不溶物を除去し、HiTrap Desalting カラムで結合バッファーに交換します。サンプル量が10 ml を超えるような場合は、サンプルのpH を上記結合バッファーpH に合わせてください。

→清澄化についての詳細:抗体精製をマスターしよう (4) 「サンプルの清澄化」の項

HiTrap イオン交換カラムを用いた精製操作

カラムの準備

カラムに気泡を入れないように注意しながら、シリンジまたはシステムに接続し、5 ml の超純水を流速1 滴/ 秒(または1 ~ 2 ml/min)で送液

カラムの平衡化

5 ml の結合バッファーを流速1 滴/ 秒(または1 ~ 2 ml/min)で送液

サンプルの添加

調製したサンプル溶液を流速1 滴/ 2 秒(または0.2 ~ 1 ml/min)で送液

非吸着成分の洗浄

5 ml の結合バッファーを流速1 滴/ 秒(または1 ~ 2 ml/min)で送液

素通り画分は廃棄せずに回収し、精製終了後にSDS-PAGE やEIA によってIgG が素通りしていないことを確認します。

サンプルの塩濃度が高すぎる場合、イオン交換カラムを素通りする場合があります。予備実験で希釈の必要性を確かめてください。

抗体の溶出

グラジエント溶出

0 ~ 50 % 溶出バッファー(Total 20 ml)でリニアグラジエントを形成して溶出

溶出液を0.5 ml ずつ回収

大部分のIgG の等電点は、Albumin や Transferrin(pI 4.7 ~ 5.0 付近)より塩基性のpI 5 ~ 9.5 です。陽イオン交換カラムにIgG を結合させ、弱く結合したAlbuminや Transferrin を15 % 溶出バッファーで溶出させて除去します(ステップワイズグラジエント)。

pH 6.0 のバッファーでは、IgG は正に、Albumin やTransferrin は負に荷電しています。正電荷をもったIgG は陽イオン交換体に結合し、負電荷をもつAlbumin やTransferrin はカラムを素通ります。

溶出画分の確認

SDS-PAGE の結果より純度が不十分であった場合には、ゲルろ過クロマトグラフィーで精製を行います。

精製IgG

バッファー交換

カラムの洗浄・保存

イオン交換クロマトグラフィーによるモノクローナルIgG の精製例

Protein A やProtein G でのアフィニティークロマトグラフィー溶出時の酸性条件で失活する不安定な抗体の場合には、精製条件が温和なイオン交換クロマトグラフィーで精製を行います。引き続いてゲルろ過クロマトグラフィーにより、分子量の差でIgG を精製します。陽イオン交換体と陰イオン交換体のどちらが適当であるかは、予備実験によって決定します。

陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製

図7

抗体の精製では、陰イオン交換クロマトグラフィーよりも陽イオン交換クロマトグラフィーが広く利用されています。

その理由は、マウスIgG の等電点はpI 5.0 ~ 9.5 で、主要夾雑タンパク質の等電点(Albumin やTransferrin はpI 4.7 ~ 5.0)よりも塩基性側にあるからです。陽イオン交換クロマトグラフィーでは、大部分の不純物はカラムを素通りし、結合した抗体は塩濃度グラジエントでさらに精製することができます。

(左)図7 陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製

サンプルの溶出はpH 6.0, 5.0, 4.0 の3 種類の溶出バッファーを順番に送液して行いました。それぞれの溶出バッファーは、ピークが下がって安定するまで送液しました。

(データ提供:Dr. Paul Steffens, Pharmacia LKB GmbH, Freiburg, Germany)

  • サンプル:マウスIgG1 を含む腹水0.2 ml を遠心(10,000×g, 10 min)し、上清を結合バッファーでバッファー交換後、0.22 µm フィルターろ過
  • Mono S HR 5/5
  • 結合バッファーA: 50 mM MES, 20 mM NaCl, pH 6.0
  • 溶出バッファーB: 50 mM MES, 1.0 M NaCl, pH 6.0
  • グラジエント: 
    1. 0~30 %B, 30 CV(カラム体積)
    2. 30~100 %B, 5 CV
  • 流速: 1.0 ml/min(300 cm/h)

サンプルの大部分はカラムを素通りするため、陽イオン交換カラムは洗浄を頻繁に行わなくても寿命を保つことが可能です。

陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製

図8

一方、陰イオン交換クロマトグラフィーでは、夾雑タンパク質もカラムに強く結合するため、抗体との分離が難しくなることもあります。

この例では、塩濃度のほかにpH グラジエントを組み合せることで、分離能を改善しています。

(左)図8 陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製

(データ提供:Dr. Paul Steffens, Pharmacia LKB GmbH, Freiburg, Germany)

  • サンプル:マウスIgG1 を含む腹水0.2 ml を遠心(10,000×g, 10 min)し、上清を結合バッファーでバッファー交換後、0.22 µm フィルターろ過
  • Mono Q HR 5/5
  • 結合バッファーA: 20 mM Bis-Tris-Propane, pH 9.5
  • 溶出バッファーB: 20 mM Bis-Tris-Propane, 1.0 M NaCl, pH 7.5
  • グラジエント: 
    1. 0~40 %B, 40 CV(カラム体積)
    2. 40~100 %B, 5 CV
  • 流速: 1.0 ml/min(300 cm/h)

* 塩濃度とpH グラジエントを組み合せて溶出しました

腹水には抗体のほかに血液凝固系のタンパク質も含まれ、カラム目詰まりの原因となります。あらかじめカプリル酸沈殿などにより清澄化して沈殿を生じるタンパク質を除去することをおすすめします(第4回を参照)。

カラムの寿命を延ばすために、カラム洗浄も頻繁に行ってください。汚れの沈着を防ぐために、精製後すぐに洗浄してください。


Protein G/A を用いたアフィニティークロマトグラフィーと、イオン交換クロマトグラフィーによるモノクローナルIgG の精製法についてご紹介しました。

モノクローナル抗体の作成過程で含まれるIgG 以外のタンパク質は非常に少ないため、ポリクローナルIgG の精製時にも増してアフィニティークロマトグラフィーが威力を発揮します。精製手法の第一選択は、アフィニティークロマトグラフィーで良いでしょう。

アフィニティー精製溶出時の酸性条件で不安定なIgG抗体のみ、他の手法を選択します。その際には、陽イオン交換クロマトグラフィーからお試しいただくのがよいでしょう。

次回は、さらに高純度にモノクローナルIgG を精製したい場合に、どのようなステップで行えばよいかについてご紹介します。


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