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イオン交換クロマトグラフィーを使いこなそう(5)

効果的な分離のための操作ポイント(2)

イオン交換イメージ画第4回に引き続き、第5回も「効果的な分離のための操作ポイント」です。今回は次の3つのトピックをとりあげて解説します。

  1. カラムの洗浄
  2. 精製スケールアップの際のポイント
  3. 理想のクロマトグラムを得るために

1. カラムの洗浄

カラムの汚染は分離能の悪化や送液不良を招き、ひいてはカラムそのものを使用できない状態にしてしまうことがあります。サンプルの前処理も大切ですが、使用後の洗浄を適切に行ってカラムを良好な状態に保つことで、安定した精製結果を得ることができます。

高濃度の塩による洗浄

イオン交換担体の最も基本的な洗浄操作であり、グラジエント溶出後のステップとして精製プロトコールに組み込まれるのが通常です。溶出ステップが終わった後に高濃度の塩(1 M NaCl)をカラムに送液し、イオン結合している残留物をカラムから除去することが目的です。送液量は5カラム体積(CV)を目安として、UV吸光度を観察しながら送液量を調節します。

一般的な夾雑物の除去

非常に強固にイオン結合してしまう物質など、サンプルによっては1 M NaCl では洗浄しきれない物質がカラムに残存することもあります。そのため、定期的に以下の洗浄を行うことでカラムを安定した状態に保つことが必要です。扱うサンプルにもよりますが、目安として4~5回の精製操作に1回はこの洗浄によってカラムのメンテナンスを行うとよいでしょう。(CV = カラム体積)

  1. 2 M NaClを2 CV以上送液します
  2. 1 M NaOHを4 CV以上送液します
  3. 2 M NaClを2 CV以上送液します
  4. 蒸留水を2 CV以上送液、またはUV吸光度のベースラインと溶出液のpHが安定するまで送液します
  5. カラム保存液(または開始バッファー)を4 CV以上、または溶出液のpHとコンダクティビティーが安定するまで送液します
  • 注1) 送液の推奨流速は各カラムによって異なります。
  • 注2) 洗浄の際は、入口に付着した汚れがカラム全体を汚染しないように、逆向きに送液することをおすすめします。
  • 注3) 汚染が著しいと考えられる場合は、1 M NaOH送液時の流速を推奨流速よりも低く設定してください。接触時間を長くすることで、洗浄効果が上がる場合があります。

強力な条件での洗浄

上記の“一般的な夾雑物の洗浄”でもカラム性能が改善しない時は、より厳しい条件での洗浄を行います。汚染の原因によってそれぞれ洗浄処理が違いますので、サンプル組成などから汚染の原因を考察してみましょう。原因が特定できれば、無駄な洗浄操作を行わず効率的にカラムを良い状態に戻すことができます。

※背圧の上昇が起きている場合では、トップフィルターに夾雑物が詰まっている要因が考えられます。沈殿しやすいサンプルや遠心/ろ過操作が不十分であったサンプルを添加した場合には、下記の洗浄よりもトップフィルターの交換を先に行うことを推奨します。洗浄よりも性能の改善に効果的であったり、フィルターに溜まっている夾雑物がカラム内部へ侵入するのを防ぐ効果があります。しかし、フィルター交換によってカラムの充填や性能に悪影響を及ぼすリスクがありますので、添付のマニュアルに沿って慎重に操作を行うことが必要です。ご不安な点や疑問などがございましたら、お気軽にバイオダイレクトラインまでお問い合わせください。
参考資料:HiLoadカラム取扱い説明書(PDF:189KB) →「フィルターネットリングの交換」の頁をご参照ください

    ●析出したタンパク質の除去

    「タンパク質分解酵素を用いる方法」と「変性剤を用いる方法」があります。どちらの方法もタンパク質の高次構造を破壊することによって、析出したタンパク質を除くことが狙いです。2つの手法について、簡単な操作フローを示します。

  • タンパク質分解酵素を用いる方法
  1. ペプシン(0.5 M NaClまたは0.1 M 酢酸に1 mg/mlで溶解)を1 CV注入し、室温で一晩もしくは37℃で1時間静置します
  2. 蒸留水を2 CV以上送液するか、あるいは溶出液のUV吸光度のベースラインとpHが安定するまで蒸留水を送液して反応溶液を洗い流します
  3. 開始バッファーまたは保存液を4 CV以上送液するか、あるいはpHとコンダクティビティーが安定するまで開始バッファーを送液します
  • 変性剤を用いる方法
  1. 6 M 塩酸グアニジンを2 CV送液します
  2. 上操作の後、直ちにpH 7 ~ 8のバッファーを5 CV以上送液します
  3. 蒸留水を2 CV以上送液するか、あるいはUV吸光度のベースラインと溶出液のpHが安定するまで蒸留水を送液します
  4. 開始バッファーまたは保存液を4 CV以上送液するか、あるいは溶出液のpHとコンダクティビティーが安定するまで開始バッファーを送液します

    ●脂質/疎水結合タンパク質/リポタンパク質の除去

    水溶液に溶けにくい物質が残存していると考えられる場合には、有機溶媒や界面活性剤を加えることで難溶性の物質を除去できます。それぞれの手法の操作例をご紹介します。

  • 有機溶媒による洗浄 (特に“脂質”の除去に有効)
  1. 70 %エタノールまたは30 %エタノールを4 CV送液します
  2. 蒸留水を2 CV以上、あるいは溶出液のUV吸光度のベースラインとpHが安定するまで蒸留水を送液して有機溶媒を洗い流します
  3. 直ちに3 CVの保存液(または開始バッファー)を送液して洗浄します
  • ☆有機溶媒による洗浄操作のポイント☆
  • ・担体やカラムの有機溶媒耐性を必ず確認してから、操作を行ってください。
  • ・有機溶媒を送液する前には、4 CV以上の蒸留水をカラムに送液して塩を洗い流してください。カラムに塩が残っていると、有機溶媒の送液によって塩が析出するおそれがあります。
  • ・有機溶媒はカラムの加圧を避けるため、低流速で送液します。


  • 界面活性剤による洗浄 (特に“疎水性タンパク質”の除去に有効)
  1. 界面活性剤を含むアルカリ性溶液または酸性溶液(例:0.1 ~ 0.5 %非イオン界面活性剤を含む0.1 M 酢酸溶液)を2 CV送液します
  2. 70 %エタノールを5 CV送液し、残留する界面活性剤を除去します
  3. 蒸留水を2 CV以上、あるいはUV吸光度のベースラインと溶出液のpHが安定するまで蒸留水を送液して洗い流します
  4. 直ちに3 CVの保存液(または開始バッファー)を送液して洗浄します
    ☆界面活性剤による洗浄操作のポイント☆
  • ・イオン交換基と同じ電荷をもつイオン性界面活性剤は絶対に使用しないでください。界面活性剤が担体と強く結合してしまい、洗浄が困難になります。


上記のような強力な条件での洗浄はカラムに負担もかかりますし、残留していると精製結果やサンプルタンパク質に影響を与えるような物質を積極的に加える操作です。なるべく不要な洗浄操作を行わないよう、サンプルの前処理や高塩濃度での洗浄といった基本的な操作は怠らないようにしましょう。

2. 精製スケールアップの際のポイント

イオン交換クロマトグラフィーでの精製時間を短縮するには、大型カラムにスケールアップするよりも、小型カラムで分離操作を繰り返し、目的成分を回収したほうが簡単です。しかし、定期的に大容量のサンプルを処理する場合には、大型カラムで精製したほうが望ましい場合があります。スケールアップの一般的なガイドラインを表にまとめました。

表1 スケールアップのためのガイドライン

維持するパラメータ 増加させるパラメータ
カラムベッド高 カラムベッド体積 (i.e. カラム断面積)
線流速(cm/h)* 流速(ml/min)
サンプル濃度 サンプル添加量
グラジエントに要するカラム体積数

イオン交換クロマトグラフィーをスケールアップする際には、以下のポイントにしたがってスモールスケールとラージスケールのサイクル時間が同じになるようにします。

  1. スモールスケールで分離を至適化します。
  2. ベッド高、サンプル濃度、サンプル体積/担体体積比を同じにします。
  3. カラムの断面積(径)を大きくして、カラム体積を増やします。
  4. 小型のカラムを使用した時の線流速とグラジエント体積/カラム体積比を変えずに分離操作を行います。

*線流速(cm/h)の求め方

 線流速(cm/h) = [流速(ml/min)]×60 / [カラムの断面積(cm2)]
           = [Z×60×4] / [π×d2]

 Z = 流速、d = カラム内径(cm)

スモールスケール時の分離パターンとの変化ができるだけなくなるよう、カラム担体とサンプルの接触時間を一定にするところがポイントです。接触時間を一定にするには上記のように“カラムベッド高”と“線流速”を維持させれば最も簡単です。状況によって“カラムベッド高”を変えなければならない時には、“カラムベッド高”と“線流速”の比(Rt値:下式参照)がスモールスケール時と同じになるよう、線流速を調整してください。

Rt = [カラムベッド高] / [線流速]

なお、スケールアップを前提にした分離方法の条件検討を行うときには、可能なかぎりスケールアップ後に使用する担体と同じものを使うようにします。分離能を高くするために粒子径の小さな担体で条件検討することがありますが、粒子径が小さいほど背圧が上昇し、スケールアップ時に制約が生じる可能性があります。

3. 理想のクロマトグラムを得るために

イオン交換クロマトグラフィーでは、以下のような流れで精製がすすむのが理想的です。
・カラムに目的分子が結合する
・グラジエント溶出前に未結合分子を洗い流す
・グラジエント溶出によって目的分子を溶出させる
・高塩濃度の溶液で結合分子を洗い流す

それでは、図1のような理想的なクロマトグラムにならないときはどうすればよいのでしょうか? 具体的な例を挙げて、確認すべき事項や対応例をご紹介いたします。

理想的なクロマトグラム

図1 理想的なイオン交換クロマトグラフィーでの分離 (グラジエント溶出)

●グラジエント溶出の前にサンプルが溶出してしまう

塩濃度が上がる前にピークが検出される場合

原因:バッファーの塩濃度が高すぎる、バッファーのpHが適切でない などが考えられます。

・まずは開始バッファーについて塩濃度などの組成を再確認してください。
・組成が間違っていない場合には、サンプルを脱塩するか開始バッファーで希釈して、イオン強度を低くします。
・陰イオン交換体を用いている場合はバッファーのpHを高く、陽イオン交換体を用いている場合はバッファーのpHを低くします。目的成分のイオン強度が相対的に上がり、カラムに結合しやすい状態になります。
・どのpHでもタンパク質が結合しない場合は、カラムに界面活性剤が結合している可能性があります。よく洗浄して除去する必要があります。

●グラジエント溶出がはじまってもサンプルが溶出し続けてしまう

塩濃度が上がり始めても吸光度がベースラインが戻らない場合

原因:サンプル添加後の洗浄が不十分です。

・吸光度のベースラインが戻る前にグラジエント溶出を始めてしまうと、溶出初期に存在する微小ピークの検出/回収を逃す可能性があります。吸光度がベースライン値に戻った状態からグラジエント溶出が始まるように、溶出前の開始バッファーによる洗浄の送液量を増やしたプロトコールに組みなおしましょう。

●サンプルが高塩濃度での洗浄中に溶出してしまう または目的タンパク質の溶出が非常に遅い

洗浄時の高塩濃度にしないとサンプルが溶出しない場合

原因:バッファーのpHやイオン強度などが要因で、タンパク質が非常に強く結合しています。

・グラジエントのイオン強度を高くします。溶出に非常に高い塩濃度を要する場合はバッファーのpHを変えたほうがよいでしょう。陰イオン交換体を用いている場合はバッファーのpHを低く、陽イオン交換体を用いている場合はバッファーのpHを高くします。

●目的タンパク質の溶出が早過ぎる

原因:バッファーのpHやイオン強度などが要因で、タンパク質の結合が弱い状態です。

・グラジエントのイオン強度を確認します。陰イオン交換体を用いている場合はバッファーのpHを高く、陽イオン交換体を用いている場合はバッファーのpHを低くすることで、結合力が上がります。

次回はイオン交換クロマトグラフィーの応用編「三段階精製」をテーマにする予定です。

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