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Location:ホームテクニカル情報配信サービスバイオダイレクトメールバイオ実験の原理と方法

バイオダイレクトメール vol.22 Technical Tips
  <生細胞をカウントする>

細胞の継代・細胞を用いた実験などにおいて生きている細胞数を測定する作業は必須です。生細胞のみをカウントするためには生細胞と死細胞の区別が必要になります。通常は生細胞より死細胞の方が膜の透過性が高い性質を利用し、色素で染色して染まり具合から生死を判断します。

トリパンブルー法

トリパンブルーは深青色の色素でタンパク質に強く結合します。死細胞は損傷などにより膜の透過性が高いのでトリパンブルーが細胞内に入り込んで全体を青く染色します。ただしサンプル中に混在している細胞片や血小板、赤血球も染色されます。それらを区別し、排除するためには熟練を要し、また生きている細胞も時間が経つと色素を取り込むため、測定にかかった時間によって算出される生存率が変動するという欠点があります。細胞数のカウントはスライドガラス上に格子状の筋が入っている血球計算盤などを用いて行うのが一般的です。

血球計算盤を用いた細胞のカウント
図1. 血球計算盤を用いた細胞のカウント
血球計算盤には目盛りがついており、目盛り内にどれだけ細胞が入っているかで細胞の数を測定します。サンプルは血球計算盤とカバーガラスの0.1 mmの隙間に封入します。

Viacount法

生細胞および死細胞の核をそれぞれ特異的に染める蛍光色素を用います。そのため染色された細胞のみがカウントされます。細胞片や血小板などが混入していても染まらないのでトリパンブルー法より正確な測定を行うことができます。細胞をカウントする機能と、使用した蛍光色素を検出する機能をあわせもつ装置を用いて測定します。

Guava PCAシリーズのアプリケーションの一つであるViaCountはViacount法を用いて生きた細胞の数を測定するシステムです。独自のキャピラリー方式により、測定に必要なサンプル量を20 μlと少量に抑えることができます。このシステムを用いて生細胞を測定した結果とトリパンブルー法を用いて測定した結果を図に2示します。Guava PCAで測定した方がより正確であることが示されました。

血球計算盤およびGuava PCAのデータの比較
図2. 血球計算盤およびGuava PCAの測定データの比較
サンプルの予測生存率(フローサイトメーター;FCMにより算出)を横軸に実際に測定した値を縦軸にグラフを作成しました。Guava PCAの方が傾きが1に近く、より正確に測定できることが示されました。

2004.3.9作成


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