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Location:ホームテクニカル情報配信サービスバイオダイレクトメールバイオ実験の原理と方法

バイオダイレクトメール vol.17 Technical Tips
<ゲノムDNAの増幅(2)>

ゲノムDNAを増幅する方法としてPCRやLong PCRなど特定の領域を増幅する方法が用いられています。この方法で増幅する場合、増幅したい領域数が多いとサンプルが足りなくなることがあります。そこで特定の領域ではなく、ゲノムDNAの全領域を増幅する方法が考え出されました。それがGenomiPhiです。原理についてはTechnical Tips vol.14でご紹介したため、ここでは操作法や増幅の信頼性についてご紹介いたします。

GenomiPhiの操作

GenomiPhiは増幅したいゲノムDNAあるいは細胞・組織にPhi 29 polymerase、ランダムヘキサマーおよびdNTPsを加えて、30℃で16~18時間反応するだけでゲノムDNAの増幅が可能です。サーマルサイクラー等以外に恒温装置でも反応することが可能です(図1)。詳しいプロトコールに関してはこちら(PDF:22KB)をご覧ください。

GenomiPhiのゲノムDNAの合成模式図
図1 GenomiPhiの操作手順

GenomiPhiの信頼性の確認

GenomiPhiがゲノムDNAを均一に増幅しているかどうか検証するため、GenomiPhi処理済サンプルをテンプレートとしてさまざまな領域をReal Time PCRで増幅しました。また等量のゲノムDNAをテンプレートとして同じ条件でPCRで増幅した場合と比較し、どれだけ増幅量に差があるか調べました。増幅に使用した領域は表1に、各領域ごとの増幅量の差は図2に示しました。調べた領域中ではPCRした際の増幅量の差が±3倍以内に収まりました。このことはGenomiPhiが全ゲノムDNAを偏りなく増幅していることを示します。

表1 増幅した領域一覧
Gene Name Locus
Flavin-containing mono-oxygenase 3 1q24.3
Intergrin beta-6 precursor 2q24.2
Collagen alpha 3(VI) chain precursor 2q37.3
Estrogen receptor 6q25.1
Actin, cytoplasmic 1 7p22.1
Glycine dehydrogenase 9p24.1
L-Lactate dehydrogenase a chain 11p15.1
Collagen alpha 3 (IX) chain precursor 20q13.33

各領域ごとの増幅量の違い
図2 Real Time PCRにおける領域ごとの増幅量の違い
GenomiPhi処理済サンプルの方が増幅量が多い場合は([GenomiPhi処理済サンプルのコピー数]/[ゲノムDNAのコピー数]-1)、GenomiPhi処理済サンプルの方が増幅量が少ない場合は(1-[GenomiPhi処理済サンプルのコピー数]/[ゲノムDNAのコピー数])の計算式に当てはめました。

GenomiPhi DNA Amplification Kit関連情報

2003.10.07


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