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バイオダイレクトメール vol.16 Technical Tips
<二次元電気泳動ゲル上のスポットのpIを推定するには?>

今回は、二次元電気泳動ゲル上のスポットのpIを知る方法をご紹介します。

ureaなどを用いた変性条件で市販のpIマーカーを泳動した場合、各マーカータンパク質は本来のpIと異なる位置に泳動されてしまします。そのため変性条件下では、タンパク質サンプルと一緒にpIマーカーを泳動することができません。

この問題を解決するには2つの方法が挙げられます。1つはpIマーカーを泳動せずにImmobiline DryStrip中のpH勾配を測定したグラフデータから読みとる方法です。この方法について詳しくはこちらのFAQ(製品Q&A)をご覧ください。

もう1つの方法は、一次元目電気泳動用(等電点電気泳動用)Immobilie DryStripにpIマーカーのみを非変性条件で泳動し 『pI ものさし』 を作製する方法です。二次元電気泳動したゲルのとなりに 『pI ものさし』 を置けば、タンパク質サンプルのpIを推定できるというわけです。Immobiline DryStripは、pH勾配がゲル中に固定されているうえ、再現性に優れているためこのような方法を利用できます。

Immobiline DryStripに泳動したpIマーカーの位置からスポットのpIを推測します。
二次元電気泳動ゲル上のスポットのIpを知る

『pI ものさし』 作製方法

【必要なもの】

(1) 泳動

* Immobiline DryStripのpH範囲に合わせて選択します

(2) 染色

  • 固定液:20% TCA
  • 洗浄液:30% メタノール、10% 酢酸
  • 染色液:0.02% CBB、30% メタノール、10% 酢酸、0.10% 硫酸銅
  • 脱色液:30% メタノール、10% 酢酸
  • 保護液:10% グリセロール
  • セロファンシート

(3) 機器

【方法】

  1. Immobiline DryStripの膨潤、泳動は通常どおりに行います。
  2. 泳動が終了したゲルを直ちに固定液に入れ、30分以上振盪します。
  3. 洗浄液に交換し、30分間振盪します。
  4. 染色液に交換し、1時間振盪します。
  5. 再び脱色液に交換し、バンドとバックグラウンドの差が明瞭になるまで脱色します。
  6. 保護液に交換して30分以上振盪し、超純水に浸したセロファンシートで覆い乾燥させます。
    そのまま乾燥させるとよじれてしまうので、Gel Band PAG Film(80-1129-36)またはOHPフィルム、ガラス版などにゲルを載せてセロファンシートで覆って乾燥させてください。

2003.09.09


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