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バイオダイレクトメール vol.14 Technical Tips
<ゲノムDNAの増幅>

ヒトゲノムの解読が終了した今でも分子生物学や法医学の分野で、ゲノムDNAの解析は重要な位置づけにあります。特にSNPやSTRなどの疾患に関連した遺伝子の多型解析には、多くの研究者が取り組んでいます。これらの多型解析を行うために従来は数十mlの血液サンプルからゲノムDNAを調製して実験を行っていました。また、サンプルが少量の場合は解析の回数が限られるため、新たな解決策が求められていました。これらの問題点を改善し、実験効率を飛躍的に向上させることのできるGenomiPhiをご紹介します。

GenomiPhiはランダムヘキサマーとPhi29 DNA Polymeraseを使ってゲノムDNAを増幅します。ランダムヘキサマーがゲノムDNAにアニーリングしたところを始点としてPhi29 DNA PolymeraseがゲノムDNAを複製します。Phi29 DNA Polymeraseはヘリカーゼ機能を持っているため、合成されたDNA鎖をはがしながら合成を続けます。そして合成されたDNA鎖に新たにランダムヘキサマーがアニーリングして、そこから合成が始まるといった反応が繰り返されてゲノムDNAが増幅されていきます。この反応は30℃で16~18時間行い、1 ngのゲノムDNAから数 ugのDNAが増幅されます。増幅後のサンプルは精製せずにそのまま次のアプリケーションに使用できます(図1)。

GenomiPhiのゲノムDNAの合成模式図
図1 GenomiPhiのゲノムDNA合成模式図

GenomiPhiはさまざまなサンプルのゲノムDNAを増幅することができます。一例として血液サンプルを増幅した結果を示します(図2, 3)。20μlの血液を溶血処理し、さらに希釈してその一部をGenomiPhiにて増幅しました(図2)。18時間のGenomiPhi増幅反応の後(図2)、PCRを行いPTGER3領域(328 bp)を増幅しました(図3)。

GenomiPhiは血液サンプルを精製せずに増幅することができ、さらに増幅後のアプリケーションに影響を及ぼさないことが示されています。
GenomiPhiは血液サンプルのほか、培養が困難な細菌や細胞株からのゲノムDNA解析への応用も可能と考えられます。

血液サンプルからGenomiPhiを用いて増幅した結果
図2 GenomiPhiで増幅した血液サンプルのアガロースゲル電気泳動図
血液凝固剤としてヘパリン(Lanes1-10)、EDTA(Lanes11-20)、クエン酸塩(Lanes21-30)を用いました。溶血処理した血液をPBSで1.2~6倍に希釈し、そのうち1μlあるいは5μlをGenomiPhiで増幅しました。"Lane M"はKiloBase DNA Markerを泳動しました。泳動には0.8 %アガロースゲルを用いました。
(図をクリックすると拡大表示されます)

GenomiPhiで増幅したサンプルをPCRした結果
図3 PTGER3領域をPCRにて増幅したサンプルのアガロースゲル電気泳動図
(図をクリックすると拡大表示されます)

GenomiPhi DNA Amplification Kit関連情報


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