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ゲノム編集

2017-3-24 12:00:00

ノックイン実験うまくいってますか?ノックイン位置決定&ドナー配列設計はEdit-R HDR Donor Designerで!(その1)

こんにちは、GEヘルスケア・ジャパン大島です。
先日3月9日(木)イルミナ社主催のイルミナiSchoolプロフェッショナルシリーズにて、「CRISPR/Cas9 ゲノム編集スクリーニングライブラリー活用のすすめLentivirus pooled ライブラリーによるノックアウトスクリーニング解析」と題したウェビナーを開催したところ、大変ご好評をいただきました。

色々なご質問をいただき、この分野への皆様の興味度が高いことを改めて感じたところです。ご参加いただいた皆さま、ありがとうございました!

「見逃した・・・」という方は、『こちらからオンデマンド』で視聴いただけます。ベンチトップで行えるスクリーニングに必要なもの、手法、解析方法から、スクリーニング後に得られるデータなどについて学びたい、という方は是非ご覧ください。

また、当日使用した資料も『こちらから』ダウンロードしていただけますので合わせてご覧いただければと思います!

さて、本題ですが、今月から2回にわたりゲノム編集でのノックイン、特に相同組換え修復(homology-directed repair:HDR)経路によるノックインに関して、Dharmaconがオススメするワークフローをご紹介いたします。

ご存じの通り、CRISPR-Cas9による二本鎖切断に続いて起こるHDRは、特定のゲノム修飾位置に隣接した配列に相同性を持つドナーテンプレートを必要とする修復経路です。適切に設計されたドナーテンプレートを用いることで、ヌクレオチドの挿入や欠失、置換など、ゲノム配列への変更が正確に導入することが出来ます。

DharmaconのEdit-R HDR Donor Designerは、ヒト、マウス、ラットの遺伝子について、ドナーテンプレートの設計を直感的で簡便に行うために開発されたWebツールです。これを使えば、

  • どのようにノックインするサイトを探せばいいの?
  • ノックインのためのドナーをどう設計すればよい?

に悩む必要はありません。

HDRによるノックインは、目的によって以下の2手法に大別されます。

手法 目的
①ssDNAドナーオリゴでノックイン 数塩基の挿入・欠失・置換
②ドナープラスミドでノックイン 蛍光タンパク質マーカーなど長い配列の挿入

今回は、「①ssDNAドナーオリゴでノックイン」に必要なドナーテンプレート配列決定までのワークフローをご紹介します。

ワークフローは3ステップからなります。

ステップ1

デザイン済みgRNAから選択、もしくはCRISPR RNA Configurator(Webツール)でカスタマイズ設計します。

ステップ2

Edit-R HDR Donor Designer – oligo(Webツール)にステップ1で決定したgRNAを入力し、

ノックインしたい場所にカーソル(オレンジ色ボックス)を移動させて、挿入・置換したい配列を「Sequence to insert」に入力
(欠失する配列は「Sequence to remove」に自動で表示されます。)

ステップ3

ステップ2で設計した配列を反映したドナーテンプレート配列が自動で作成されて完成!Add to Cartで注文してください。

※CRISPR RNA ConfiguratorおよびEdit-R HDR Donor Designerの使用法の詳細は、『製品検索・WEB注文マニュアル』をご覧ください。

特定配列がノックインされた目的の細胞を得るまでに、ゲノム編集効率、DNAドナーオリゴの濃度やホモロジーアームの長さなど、様々な条件が絡み合います。

Dharmaconの研究チームでは、一つの目安とするために、U2OS細胞を用いて最大25%のノックイン効率を得るための実験条件をアプリケーションノートとして作成しました。

※細胞(株)によってゲノム編集やノックイン効率は変わりますので、ご使用になる細胞(株)で最適な条件検討が必要です。

本アプリケーションノートでは、ヒトVCPおよびEMX1遺伝子へのDNA配列のノックイン効率を、異なるCas9発現条件下で評価するとともに、ドナーオリゴ濃度やホモロジーアームの長さを変えた時のノックイン効率も検討しています。

詳しくは、アプリケーションノートをご覧ください。(PDFアイコンからダウンロードいただけます)

また、『CRISPR-Cas9によるHDR最適化(Optimizing homology-directed repair (HDR) results with CRISPR-Cas9)』と題したオンデマンドウェビナーもご覧いただけます。

「これからssDNAドナーオリゴでのノックイン実験を始める」
「ドナーテンプレートの設計で困っている・・・」
という方は、是非『Edit-R HDR Donor Designer – oligo』をお試しください。ご不明な点やご質問などございましたらお気軽に弊社までお問い合わせください。

次回は、「②ドナープラスミドでノックイン」について、『新製品のEdit-R HDR Plasmid Donor Kit- mKate2』蛍光レポーター導入用のドナープラスミド構築までのワークフローをご紹介する予定です。

 

ところで、Dharmaconの遺伝子発現調節技術によって作成された細胞を用いたアッセイ法の一つとして、画像解析はいかがですか?

先月号にて、超・高解像度顕微鏡DeltaVisionシリーズで撮影した画像をご紹介したところ、興味をもっていただいた方がいらっしゃったため、今回から「今月の超・高解像度画像紹介」としてシリーズ化し、お客様のサンプルで撮影した実例をご紹介したいとおもいます!

今月の超・高解像度画像紹
これは高解像度顕微鏡DeltaVision Eliteで撮影したマウス線条体の画像です。「共焦点レーザー顕微鏡と比較して画像取得が速く印象的でした。zスタック画像取得の上で大きなメリットになると思います。デコンボリューション後の画像は共焦点のものに匹敵する分解能を持っていると感じました。」というお声をいただいています。(ご協力:北海道大学 医学部 解剖学講座 解剖発生学分野 内ヶ島 基政 様)
詳しくは『こちら»』から

DeltaVisionシリーズでのお試し撮影、その他詳細については以下よりお問合せください。

「困った・・・」を抱えたお客様や、「ゲノム編集技術で新しい実験に取り組みたい」というお客様のところへ伺って、一緒に解決方法を探していくことも我々Dharmacon担当者の重要なミッションです。一人で悩まずDharmaconまでご相談ください!

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不定期ではございますが、役に立つ情報をお伝えさせていただきます。
今後ともDharmaconをよろしくおねがいいたします!



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この記事の筆者

大島

大島 英之
GEヘルスケア・ジャパンにてDharmaconの担当をしております大島と申します。
私の今年の目標は、「siRNA、ゲノム編集と言えばGEの大島へ!」のスローガンを皆さまに覚えていただくことといたしました。 今年も、さらにパワーアップして皆様のお役に立ちたいと思っております!

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